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(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江西南昌 330200; 2.江西師范大學(xué),江西南昌 330022)

蛋白質(zhì)與糖之間的反應(yīng)稱為美拉德反應(yīng)或非酶褐變反應(yīng),在食品加工貯藏及人體內(nèi)廣泛存在[1]。該反應(yīng)一方面可賦予食品誘人的顏色、增加消費者食欲,還可以掩蓋食物的過敏原表位、降低蛋白質(zhì)的致敏性[2-3];另一方面,糖基化反應(yīng)會產(chǎn)生丙烯酰胺、5-羥甲基糠醛、糖基化終產(chǎn)物(AGEs)等有害物質(zhì)[1,4-5],這些物質(zhì)可直接或者間接導(dǎo)致心腦血管疾病、腎臟疾病、糖尿病等發(fā)生,危害極大[1,6]。由此可見,蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)具有雙面性,這與蛋白質(zhì)的種類、糖的種類、反應(yīng)時間、反應(yīng)環(huán)境等因素有關(guān)。因此,如何有效調(diào)控糖基化反應(yīng)進程,不產(chǎn)生危害物,是當前蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)研究中需要解決的問題之一。一些研究者采用天然抗氧化劑抑制糖基化反應(yīng)過程,實現(xiàn)對危害物的抑制,由于各種抗氧化劑的植物來源及純度不同,同時,這些抗氧化劑對不同處理溫度、時間、濕度、pH等因素敏感性各異,在抑制效果方面差異較大[7-10]。

表兒茶素是一種良好的天然抗氧化劑[11],可作為蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)的潛在抑制劑。目前對表兒茶素的研究主要集中于提取、純化及其與其它天然抗氧化劑活性比較等方面[12-14],而對模擬人體生理條件下蛋白質(zhì)糖基化抑制效果評價、糖基化產(chǎn)物理化性質(zhì)分析等方面的研究較少。為此,本研究構(gòu)建人血清蛋白-核糖美拉德反應(yīng)模型,模擬人體生理條件,探究表兒茶素對蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)的抑制及糖基化產(chǎn)物的性質(zhì)影響,從而為人體生理條件下抑制糖基化危害物的產(chǎn)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表兒茶素 ≥98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;D-核糖 ≥99%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;人血清蛋白 ≥96%,美國Sigma公司;磷酸氫二鈉、三氯乙酸、疊氮化鈉、鄰苯二甲醛、十二烷基硫酸鈉等 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

AB104-N電子天平 上海第二天平儀器廠;F-7000熒光分光光度計 日本日立公司;T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;DV-III流變儀 美國Brookfield公司;4800 Plus MALDI-TOF-MS質(zhì)譜 ABI Science公司;Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳儀 美國Bio-Rad伯樂公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;PHS-3G型pH計 上海雷磁儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖基化反應(yīng)模型建立及糖基化產(chǎn)物制備 采用0.2 mol/L的PBS緩沖溶液(pH7.4)配制50 mg/mL的人血清蛋白(HSA)溶液,按照1∶1比例添加等質(zhì)量的D-核糖,并在混合溶液中添加0.05%的疊氮化鈉,混勻;取2 mL混合液于離心管中,分別加入0.5 mL含有0.01、0.02、0.03、0.04 mol/L表兒茶素的PBS緩沖溶液,以未加表兒茶素的PBS緩沖液為對照。然后將離心管放入37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵化5 d。反應(yīng)結(jié)束后,分析不同表兒茶素添加量對糖基化的抑制率及糖基化產(chǎn)物的分子量、熱集聚程度、pH、粘度、自由氨基、表面疏水性的影響。

1.2.2 糖基化反應(yīng)抑制率的測定 參照文獻[15]方法,略有修改,用0.2 mol/L的PBS緩沖溶液(pH7.4)將樣品稀釋至1 mg/mL,按1∶1體積比加入20%的三氯乙酸溶液,10000 r/min離心10 min,棄去上清液,沉淀用1.6 mL的磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L,pH7.4)復(fù)溶,然后進行熒光測定,設(shè)定激發(fā)波長為350 nm,發(fā)射波長為420 nm,狹縫寬度為5 nm,磷酸鹽緩沖溶液為空白,抑制率的計算公式如下:

抑制率(%)=(1-F實驗組/F對照組)×100

1.2.3 分子量的測定 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法測定分子量,具體操作參照鐘比真[16]和Totlani V M[17]等方法。

1.2.4 熱聚集度的測定 參照文獻[18]報道的方法,略微修改,用0.2 mol/L的PBS緩沖溶液(pH7.4)將樣品稀釋至1 mg/mL,將稀釋后的樣品分別加熱至30、40、50、60 ℃,采用紫外可見分光光度計測定各溫度下樣品在600 nm處的吸光值,以磷酸鹽緩沖溶液為空白。

1.2.5 pH測定 采用pH計測定樣品的pH。

1.2.6 自由氨基測定 采用鄰苯二甲醛(OPA)方法[10]測定自由氨基的含量。OPA試劑的配制:稱40.0 mg OPA溶于1.0 mL甲醇,再加入2.5 mL 20%(w/w)SDS,25.0 mL 0.1 mol/L硼砂,100 μLβ-巰基乙醇,最后用蒸餾水定容到50 mL。取200 μL處理樣品,加入配置好的OPA溶液4.0 mL,混勻,于35 ℃條件下反應(yīng)2 min,以蒸餾水為對照,在340 nm處測定吸光值。以賴氨酸為標準物質(zhì),以濃度為橫坐標,340 nm下的吸光值為縱坐標制作標準曲線,標準曲線方程為:y=2.207x+0.04(R2=0.999),根據(jù)方程計算樣品中自由氨基的含量。

1.2.7 表面疏水性測定 采用ANS熒光探針法[19]測定樣品的表面疏水性,將反應(yīng)后的樣品用PBS(0.05 mol/L,pH7.4)稀釋成1、0.5、0.1、0.05、0.02 mg/mL溶液。取2 mL不同濃度的樣品與20 μL 8 mmol/L ANS(0.02 mol/L,pH7.4)溶液混合后,測定其熒光強度。設(shè)定激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為385 nm和400～600 nm,掃描速度為240 nm/min,激發(fā)狹縫寬度為10 nm,發(fā)射的狹縫寬度為10 nm,電壓為400 V。以橫坐標為樣品濃度(mg/mL),縱坐標為熒光強度作圖,采用線性回歸分析進行曲線擬合,曲線的斜率即為樣品的表面疏水性(H0)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗重復(fù)3次,實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.0繪圖,用SPSS 11.5軟件進行顯著性分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 表兒茶素對HSA糖基化反應(yīng)的抑制率

從圖1可以看出,與未添加表兒茶素的反應(yīng)體系相比,添加了表兒茶素的反應(yīng)體系的糖基化反應(yīng)抑制率在19%～80%之間,隨著表兒茶素加入量的增加,抑制率顯著提高(p<0.05),當達到0.04 mol/L時,抑制率達到最大值。實驗結(jié)果顯示在模擬人體環(huán)境下,表兒茶素能夠顯著性的抑制HSA-核糖體系糖基化程度(p<0.05)。

圖1 表兒茶素對HSA糖基化反應(yīng)的抑制率Fig.1 Inhibition rate of epicatechin on glycosylation of HAS注:不同字母表示在0.05水平差異顯著,圖4～圖6同。

2.2 表兒茶素對HSA糖基化產(chǎn)物分子量的影響

由圖2中的SDS-PAGE圖譜可以看出,與未添加表兒茶素的反應(yīng)體系相比,添加不同濃度表兒茶素的HSA的分子量略有減少,且添加0.04 mol/L表兒茶素的體系中未產(chǎn)生聚合物。

圖2 不同濃度的表兒茶素對HSA糖基化產(chǎn)物分子量的影響Fig.2 Effects of different concentration epicatechin on the molecular weight of HSA glycosylation products 注:1、2、3、4、5分別為添加0、0.01、0.02、0.03、0.04 mol/L表兒茶素的HSA糖基化產(chǎn)物的電泳條帶。

通過MALDI TOF MS質(zhì)譜圖(圖3)可以看出:天然HSA的分子量為66.4 kDa,未添加表兒茶素HSA糖基化反應(yīng)后分子量提高到70.0 kDa,添加0.04 mol/L表兒茶素的體系中,產(chǎn)物的分子量為67.8 kDa,添加表兒茶素后,糖基化產(chǎn)物的分子量減少了,可見,表兒茶素可以有效地抑制HSA糖基化反應(yīng)。

圖3 不同濃度的表兒茶素對HSA糖基化產(chǎn)物MALDI TOF MS圖譜的影響Fig.3 MALDI TOF MS of HSA glycosylation products with different concentration epicatechin注:A、B、C分別為天然HSA、添加0.04 mol/L表兒茶素的HSA糖基化產(chǎn)物和未添加表兒茶素的HSA糖基化產(chǎn)物的MALDI TOF MS圖譜。

2.3 表兒茶素對HSA糖基化產(chǎn)物熱聚集度的影響

從圖4可以看出,天然HSA對熱非常敏感,當溫度不斷升高至60 ℃時,蛋白發(fā)生明顯變性和聚集;未添加表兒茶素的HSA糖基化產(chǎn)物的熱變性程度最低。隨著表兒茶素濃度的增加,HSA糖基化產(chǎn)物的熱集聚程度隨溫度升高而呈上升的趨勢。當表兒茶素添加量達到0.04 mol/L時,其吸光值隨著溫度的增加而顯著提高(p<0.05),熱聚集度增加較大,說明HSA發(fā)生了聚集變性,穩(wěn)定性差。一般情況下,糖基化反應(yīng)程度與蛋白質(zhì)的熱聚集程度具有相關(guān)性,糖基化可以提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[20]。但從圖4可知,體系的熱穩(wěn)定性變差,說明糖基化程度不高,表兒茶素的添加能夠顯著地抑制糖基化反應(yīng)。

圖4 不同表兒茶素濃度對HSA糖基化產(chǎn)物熱集聚度的影響Fig.4 Effects of different concentration epicatechin on the thermal aggregation of HSA glycosylation products

2.4 表兒茶素對HSA糖基化產(chǎn)物pH的影響

由圖5可知,與HAS的PBS溶液pH為7.4以及未添加表兒茶素的糖基化產(chǎn)物pH為6.5相比,隨著表兒茶素濃度的增加,HSA糖基化產(chǎn)物的pH顯著升高(p<0.05),在0.04 mol/L時,pH達到最大(<7.4),與濃度為0.03 mol/L時的pH無顯著差異(p>0.05)。一般來說,蛋白質(zhì)糖基化程度越高,pH降低越顯著[21],添加表兒茶素后pH的增加,說明糖基化進程受阻,糖基化反應(yīng)被抑制,相對于起初HAS的PBS溶液pH為7.4,pH的下降主要是由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中有機酸(甲酸、乙酸)的生成以及氨基的消耗造成的。

圖5 不同濃度表兒茶素對HSA糖基化產(chǎn)物pH的影響Fig.5 Effects of different concentration epicatechin on pH of HSA glycosylation products

2.5 表兒茶素對HSA糖基化產(chǎn)物自由氨基、表面疏水性的影響

從圖6可以看出隨著表兒茶素濃度的增加,HSA糖基化產(chǎn)物的自由氨基、表面疏水性也隨之顯著性增加(p<0.05),說明表兒茶素在一定程度上抑制了糖基化反應(yīng)(p<0.05),其原因可能是抑制劑阻止了蛋白質(zhì)氨基與糖羰基的結(jié)合,使得蛋白分子結(jié)構(gòu)部分展開,自由氨基增加,包埋在分子內(nèi)部的疏水性殘基更多的暴露出來,表面疏水性增加[22-23]。

圖6 表兒茶素對糖基化產(chǎn)物自由氨基、表面疏水性的影響Fig.6 Effects of different concentration epicatechin on the free amino group content and surface hydrophobicity of HSA glycosylation products

3 結(jié)論

研究顯示,在模擬生理條件下以人血清蛋白與核糖構(gòu)建的美拉德反應(yīng)體系中,添加表兒茶素對蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)具有抑制作用,抑制效果隨著表兒茶素添加量的增加而增加,當添加量為0.04 mol/L時,對HSA糖基化的抑制率近80%,添加表兒茶素后糖基化產(chǎn)物的分子量變小;通過分析糖基化產(chǎn)物的性質(zhì)可以看出隨著表兒茶素添加量的增加,產(chǎn)物的pH、熱集聚程度、自由氨基、表面疏水性增加,這些性質(zhì)變化說明表兒茶素對糖基化反應(yīng)具有抑制效果。該研究結(jié)果可以為生理條件下糖基化反應(yīng)危害物的控制提供理論依據(jù)。同時,為了使表兒茶素抑制糖基化反應(yīng)的研究理論體系趨于完整,其抑制反應(yīng)的內(nèi)在機制及糖基化產(chǎn)物的其它理化性質(zhì)還需要進一步研究。

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