ε—聚賴氨酸對尿液中常見細(xì)菌的體外抑菌效果及對尿蛋白測定影響的研究

郭國威 許堅(jiān)鋒 陳錦文

【摘要】 目的：了解ε-聚賴氨酸（ε-Poly-L-lysine，ε-PL）對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌及銅綠假單胞菌等四種尿液中常見細(xì)菌的體外抑菌效果，并探討其對尿蛋白測定的影響。

方法：使用肉湯稀釋法將ε-PL倍比稀釋后加入等量細(xì)菌懸液中，于35 ℃溫箱內(nèi)24 h后觀察ε-PL對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）。同時將不同濃度的ε-PL加入尿液中，分析其對尿蛋白測定的干擾。結(jié)果：ε-PL溶液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌及銅綠假單胞菌等尿液中常見細(xì)菌的體外抑菌均有明顯效果，MIC分別為0.02、0.01、0.04及0.01 mg/mL，其中ε-PL對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌效果最好；原尿液、加蒸餾水尿液中尿蛋白含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；含不同濃度ε-PL尿液標(biāo)本中尿蛋白含量均明顯高于原尿液，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且隨著尿液中ε-PL濃度的增加對蛋白測定的影響就越大。結(jié)論：ε-PL能有效抑制尿液常見細(xì)菌的生長，能用于尿液樣本防腐，但不適用于24 h尿蛋白測定標(biāo)本的防腐。

【關(guān)鍵詞】 ε-聚賴氨酸； 最小抑菌濃度； 尿蛋白； 干擾

【Abstract】 Objective：To understand the in vitro bacteriostatic effect of ε-Poly-L-lysine（ε-PL） on four common bacteria in urine，including Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa，and to explore its influence on urinary protein determination.Method：The broth dilution method was used to dilute the ratio of ε-PL and add the same amount of bacterial suspension.The MIC of ε-PL to Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa was observed after 24 hours in the incubator at 35℃.At the same time，different concentrations of ε-PL were added into the urine to analyze the interference of urine protein determination.Result：Solution ε-PL has obvious bacteriostatic effect on common bacteria in urine，such as Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa，MIC were 0.02，0.01，0.04 and 0.01 mg/mL respectively，among them，ε-PL had the best bacteriostatic effect on Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.The urine protein in original urine and urine added with distilled water was compared，the differences was not statistically significant（P>0.05）.The urine protein in urine samples containing different concentrations of ε-PL were significantly higher than those of original urine，the differences were statistically significant（P<0.05），and the higher the concentration of ε-PL in urine，the greater the effect on the determination of protein.Conclusion：ε-PL can effectively inhibit the growth of common bacteria in urine，and can be used for the preservation of urine samples，but not for the preservation of 24 hours urine protein test specimens.

【Key words】 ε-Poly-L-lysine； MIC； Urine protein； Interference

First-authors address：Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine Zhuhai Hospital，Zhuhai 519015，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.33.038

ε-聚賴氨酸（ε-Poly-L-lysine，ε-PL）是1977年由日本科學(xué)家在放線菌培養(yǎng)過濾液中發(fā)現(xiàn)的一種新型天然防腐劑，是由25～30個賴氨酸殘基的同型單體聚合物組成，賴氨酸通過α-羧基和ε-氨基形成的酰胺鍵連接在一起而成[1]。ε-PL是由微生物分泌的、具廣譜抗微生物活性的多肽性類物質(zhì)，易被生物降解，對人體無害，目前廣泛應(yīng)用于食品防腐中[2]。尿液樣本在常溫下長時間存放會有細(xì)菌生長從而影響尿液某些成分發(fā)生改變而影響檢驗(yàn)結(jié)果，為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，通常采用加入防腐劑的方法來抑制細(xì)菌生長。目前尿24 h蛋白測定常采用甲苯作為防腐劑，但甲苯對人體有致癌作用，探索新的尿24 h蛋白標(biāo)本防腐劑具有重要意義。為此，本研究通過ε-PL對尿液中常見菌的抑菌效果，并探索其對尿蛋白測定的影響，驗(yàn)證ε-PL作為尿液防腐劑的可能性?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC218531及糞腸球菌ATCCA29212均由法國梅里埃公司提供。

1.2 儀器與試劑 9 mm血培養(yǎng)基由廣州迪景公司提供；比濁儀由法國梅里埃公司提供；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司提供；ε-PL購于鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；VITROS350干式生化分析儀及尿蛋白試劑由美國強(qiáng)生公司提供。

1.3 方法

1.3.1 ε-PL培養(yǎng)液的配制 稱取適量ε-PL，溶解于無菌生理鹽水中，配制成ε-PL防腐劑原液25.6 mg/mL備用。取無菌試管12支（按順序標(biāo)記），除第1管外，每管加入尿液1 mL；先吸取防腐劑原液2 mL加入第1管中，再從第1管中吸取1 mL防腐劑原液加入第2管中，混勻后吸出1 mL加入第三管中，依次類推至第12管后，吸出1 mL棄去。這樣各管中防腐劑的濃度依次為：25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.003 125 mg/mL。每12管為一組并做好標(biāo)記，一共設(shè)置4組分別對應(yīng)4種受試菌株。另每組設(shè)“尿液對照”和“測試菌生長對照”各一管。

1.3.2 接種細(xì)菌及細(xì)菌培養(yǎng) 分別挑取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌制備0.5麥?zhǔn)蠁挝坏氖茉嚲?，?50 μL菌液加入15 mL新鮮無菌尿液中，混勻，取1 mL依次加入12支試管中，混勻，則得到ε-PL最終濃度依次為1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25、0.000 625 mg/mL的培養(yǎng)基。對照管不加菌液，測試菌生長對照管不加防腐劑。將上述處理的不同濃度ε-PL培養(yǎng)基放置室溫中24 h后轉(zhuǎn)種至血平板，35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h后觀察結(jié)果。

1.3.3 含不同ε-PL濃度的尿液配制及蛋白濃度測定 收集正常尿液混勻備用（干化學(xué)試紙陰性），將混合尿液分成7組，每組樣本量為10 mL：第1組原尿10 mL，第2組9 mL原尿+1 mL蒸餾水，其余5組9 mL原尿分別加入1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 mg/mL的ε-PL溶液1 mL，使其最終尿液ε-PL混合液中ε-PL濃度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL。采用鄰苯二酚紫染料結(jié)合比色法，使用VITROS350強(qiáng)生干式生化分析儀對各溶液中的蛋白濃度進(jìn)行檢測，每組測定三次取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ε-PL對尿液常見菌的抑菌情況 用倍比肉湯稀釋法測得ε-PL對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌均有抑菌效果，最小抑菌濃度（MIC）分別為0.02、0.01、0.04及0.01 mg/mL，其中ε-PL對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌效果最好。見表1。

2.2 不同濃度的ε-PL溶液對尿蛋白測定的影響 采用VITROS350干式生化分析儀對混有不同濃度ε-PL的尿液標(biāo)本進(jìn)行尿蛋白測定，原尿液蛋白含量為（96.36±1.26）mg/L，加蒸餾水尿液中尿蛋白含量為（95.60±1.22）mg/L，與原尿液尿蛋白含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.615，P=0.310）；而含0.01、0.02、0.04、0.08及0.16 mg/mL不同ε-PL濃度尿液標(biāo)本中尿蛋白含量分別為（122.30±2.20）、（146.90±1.30）、（177.93±0.15）、（341.30±2.40）及（695.70±7.47）mg/L，均明顯高于原尿液，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.063、4.190、5.522、6.924、9.217，P=0.041、0.036、0.023、0.015、0.006），且隨著尿液中ε-PL濃度的增加對蛋白測定的影響就越大。

3 討論

腎臟作為人體調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的重要樞紐，機(jī)體每天生理排泄一定尿液及尿液中各類物質(zhì)尿液成分變化能反映腎小球和腎小管功能，檢測尿液量和尿蛋白含量對腎功能，診斷治療和預(yù)后判斷都有一定的臨床意義[3-4]。24 h尿蛋白定量也稱為24 h尿蛋白排泄率，是通過收集24 h的全部尿液，來測定其中的蛋白質(zhì)的含量，進(jìn)而計算出24 h內(nèi)的蛋白總量，因此可以準(zhǔn)確地反映患者一天之中蛋白質(zhì)丟失的情況。正常人的腎小球?yàn)V液中存在小分子量的蛋白質(zhì)，在通過近曲小管時絕大部分又被重吸收，因此終尿中的蛋白質(zhì)含量<150 mg/24 h。當(dāng)尿中蛋白質(zhì)超過正常范圍時，稱為蛋白尿，是腎臟疾病常見的臨床表現(xiàn)，一些全身性疾病亦可出現(xiàn)蛋白尿[5-6]。尿液樣本在常溫下長時間存放會有細(xì)菌生長從而影響到尿液某些檢測項(xiàng)目的結(jié)果，通常采用加入防腐劑的方法來抑制細(xì)菌生長。目前常用尿液24 h蛋白測定常用防腐劑為甲苯，雖然能起到尿液防腐作用，但長期使用會對患者或檢驗(yàn)人員產(chǎn)生一定傷害[7-8]。因此，尋找安全可替代尿液防腐劑是目前研究的熱點(diǎn)問題。

ε-PL是一種由賴氨酸單體通過ε-氨基和α-羧基形成酰胺鍵聚合而成的均聚物[9-10]，具獨(dú)特功能的多肽結(jié)構(gòu)，也是一種生物堿，具有廣譜抗菌活性[11]、抗噬菌體活性、安全性高、水溶性和熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，且易被生物降解，對人體無毒害，通常用作食品防腐劑[12-14]。ε-PL抑菌機(jī)制主要是將細(xì)菌細(xì)胞壁逐步破壞，從而使得堿性磷酸酶滲出，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，使其在細(xì)胞膜上形成穿孔并喪失其生理功能，先導(dǎo)致小分子物質(zhì)滲出，使得胞外離子含量升高，當(dāng)細(xì)胞膜發(fā)生崩解時大分子物質(zhì)溢出，影響細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，起到抑菌作用[15-16]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)尿液中ε-PL濃度達(dá)到0.04 mg/mL及以上時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌及銅綠假單胞菌等四種尿液中常見細(xì)菌均有抑菌作用，即0.04 mg/mL為尿液中最佳抑菌濃度，為尿液防腐的用量提供一定參考理論依據(jù)，與李宇雄等[17]報道相一致，這正說明了ε-PL溶液可用于尿液的防腐，且效果明顯、安全。

目前臨床實(shí)驗(yàn)室24 h尿蛋白定量檢測主要采用染料結(jié)合法，其具有靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便、快速、可自動化的特點(diǎn)[5-6]。本研究采用鄰苯二酚紫染料結(jié)合比色法來檢測ε-PL溶液對24 h尿蛋白測定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，原尿液、加蒸餾水尿液中尿蛋白含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；而含0.01、0.02、0.04、0.08及0.16 mg/mL不同ε-PL濃度尿液標(biāo)本中尿蛋白含量均明顯高于原尿液，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且隨著尿液中ε-PL濃度的增加對蛋白測定的影響就越大。提示當(dāng)尿液中ε-PL溶液濃度達(dá)到0.01 mg/mL時就對尿蛋白測量結(jié)果產(chǎn)生明顯干擾，且干擾程度隨著尿液中ε-PL溶液濃度的增加而增加，這除了可能與ε-PL結(jié)構(gòu)中存在大量的賴氨酸殘基可與染料結(jié)合從而干擾測定有關(guān)[18]，也可能與ε-PL富含陽離子，易與帶有陰離子的物質(zhì)有強(qiáng)的靜電作用力結(jié)合有關(guān)[19-20]。

綜以上述，ε-PL濃度達(dá)到0.04 mg/mL及以上對尿液中常見細(xì)菌均有明顯抑菌作用，但當(dāng)ε-PL濃度達(dá)到0.01 mg/mL時對尿蛋白測定就產(chǎn)生明顯干擾現(xiàn)象。因此ε-PL溶液可用于尿液的防腐，但不能用于尿蛋白測定的尿液防腐。

參考文獻(xiàn)

[1]姚昕，秦文.ε-聚賴氨酸和臭氧處理對石榴果實(shí)貯藏品質(zhì)影響的多變量分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2017，43（8）：254-261.

[2]陳曉，李可可，余甜，等.ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌生長及生物膜形成的影響[J].中國抗生素雜志，2018，43（1）：91-95.

[3] Pazmino P A.Current Concepts on Diabetic Nephropathy and 2014 Data on Diabetic Renal Failure in Texas[J].Tex Med，2016，112（7）：e1.

[4] Hunt S，Hopkins P，Nanjee N，et al.OS 06-04 changes in gene expression path ways predict delayed sodium excretion during saline in fusions[J].Hypertens，2016，34（Suppl l）：e62-e63.

[5]邱杰山，沈水娟，劉琪，等.慢性腎臟病患者晨尿微量白蛋白/尿肌酐比值與24 h尿蛋白定量的相關(guān)性分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（3）：693-696.

[6]段峰.慢性腎炎患者尿蛋白/尿肌酐比值與24小時尿蛋白定量的相關(guān)性分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2017，14（Z1）：191-194.

[7]鄧敬儀，董慧敏，李小敏，等.甲苯在24小時尿液中防腐效果[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，25（4）：526-528.

[8]張建強(qiáng)，鄒正平，謝江燕，等.臨床常見防腐劑對尿液電導(dǎo)率測定的影響[J].中醫(yī)藥指南，2015，13（1）：12-13.

[9]吳勤，孟岳成，李延華，等.ε-聚賴氨酸在藍(lán)莓汁飲料中的應(yīng)用研究[J].食品科技，2015，40（6）：71-75.

[10] Zhou Y P，Ren X D，Wang L，et al.Enhancement of ε-poly-lysine production in ε-poly-lysine-tolerant Streptomyces，sp.by genome shuffling[J].Bioprocess Biosyst Eng，2015，38（9）：1705-1713.

[11]劉璐，魯曉翔，陳紹慧，等.ε-聚賴氨酸采后處理對櫻桃冰溫貯藏期間品質(zhì)的影響[J].食品工業(yè)科技，2015，36（12）：319-323.

[12] Ren X D，Chen X S，Zeng X，et al.Acidic pH shock induced overproduction of ε-poly-L-lysine in fed-batch fermentation by Streptomyces sp.M-Z18 from agro-industrial by-products[J].Bioprocess Biosyst Eng，2015，38（6）：1113-1125.

[13]趙國萍，李迎秋.ε-聚賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用及檢測方法研究進(jìn)展[J].齊魯工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，29（3）：49-53.

[14] Li S，Chen X，Dong C，et al.Combining genome shuffling and interspecific hybridization among Streptomy-ces improved e-poly-L-lysine production[J].Appl Biochem Biotechnol，2013，169（1）：338-350.

[15]石慧，李嬋娟，張俊紅.ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌及其應(yīng)用研究概述[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2016，42（9）：263-269.

[16] Geng W，Yang C，Gu Y，et al.Cloning of ε-poly-L-lysine（ε-PL） synthetase gene from a newly isolated ε-PL-producing Streptomyces albulus NK660 and its heterologous expression in Streptomyces lividans[J].Microb Biotechnol，2014，7（2）：155-164.

[17]李宇雄，董明，郭國威，等.ε-聚賴氨酸抑菌效果及對尿鉛測定影響研究[J].中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2017，44（1）：80-83.

[18]譚之磊，武雅楠，方思棋，等.ε-聚賴氨酸與卵白蛋白間相互作用及對抑菌活性的影響[J].食品科學(xué)，2018，39（1）：73-77.

[19]徐巧玲，孫鳳軍，馮偉，等.DNase I對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，35（9）：1356-1359.

[20]張智瑋，喬林爽，趙月輝，等.norD對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2016，28（12）：1379-1381.

（收稿日期：2018-09-11） （本文編輯：董悅）