張晶，葉碧霞，左勇*，謝光杰，張?chǎng)?，孫時(shí)光

(1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 瀘州 646000)

甜面醬是以面粉為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成的半固態(tài)調(diào)味品，其味甜咸適宜，鮮味濃郁，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。甜面醬的生產(chǎn)可概括為前期制曲、中期拌鹽水以及后期發(fā)酵[2]。傳統(tǒng)的自然曬露發(fā)酵方式生產(chǎn)的甜面醬，其成品顏色鮮艷，口感細(xì)膩，酯香濃郁，但由于生化反應(yīng)緩慢，發(fā)酵周期較長(zhǎng)，需12個(gè)月左右才能使面醬成熟，從而影響企業(yè)產(chǎn)能的進(jìn)一步提升。研究表明：可對(duì)傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式進(jìn)行改進(jìn)[3，4]，通過(guò)添加酶制劑及人工保溫發(fā)酵，能夠縮短生產(chǎn)周期，但其成品質(zhì)量不及傳統(tǒng)自然曬露方式所生產(chǎn)的甜面醬[5]。據(jù)報(bào)道[6，7]，基于傳統(tǒng)自然曬露以及人工保溫發(fā)酵兩種方式提出的先保溫后曬露的生產(chǎn)方式用于生產(chǎn)甜面醬，在縮短生產(chǎn)周期的同時(shí)，可彌補(bǔ)人工保溫所造成的品質(zhì)不足的缺陷，因而具有應(yīng)用前景。

目前，對(duì)于先保溫后曬露發(fā)酵方式的研究處于起步階段，其工藝有待進(jìn)一步探究。通過(guò)對(duì)甜面醬在保溫發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成時(shí)期研究表明，發(fā)酵后期為甜面醬保溫發(fā)酵中主體風(fēng)味物質(zhì)的形成時(shí)期[8]。本研究將通過(guò)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間段的醬醪進(jìn)行理化分析，初步探究大分子物質(zhì)快速降解的階段，并以其作為分段依據(jù)，為兩段式發(fā)酵技術(shù)中最佳保溫發(fā)酵時(shí)間的確定提供理化指標(biāo)等參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

人工保溫發(fā)酵的甜面醬樣品，發(fā)酵時(shí)間以拌鹽水入池為0天計(jì)算。人工保溫發(fā)酵周期通常是60天，拌鹽水后每隔1周需進(jìn)行倒醅，以達(dá)到大分子物質(zhì)的充分降解。結(jié)合類似研究，故取樣時(shí)間設(shè)置為0，5，10，15，20，25，30，35，40，47，54，60天。

1.2 儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；pH酸度計(jì) 奧豪斯儀器(上海)有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 理化指標(biāo)測(cè)定

含水量的測(cè)定：采用快速水分含量測(cè)定儀；總酸及氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：采用直接滴定法以及甲醛滴定法；還原糖含量的測(cè)定：采用斐林法[9]。

2.2 酶活力測(cè)定

淀粉酶活力的測(cè)定：采用碘量法；中性蛋白酶以及酸性蛋白酶活力的測(cè)定：依據(jù)國(guó)標(biāo)法[10]。

2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較[11]。在0.05水平上檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果差異顯著性，試驗(yàn)結(jié)果采用Origin作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 甜面醬保溫發(fā)酵過(guò)程中含水量的變化情況

保溫發(fā)酵過(guò)程中，水分含量直接影響微生物的生長(zhǎng)代謝，同時(shí)也影響各種酶活力的大小，監(jiān)測(cè)含水量的變化情況能夠?qū)崟r(shí)反映發(fā)酵是否正常。水分含量的變化情況見(jiàn)圖1。

圖1 保溫發(fā)酵過(guò)程中含水量的變化Fig.1 Changes of moisture content at different insulation fermentation time

注：誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同字母表示含水量存在顯著性差異(P<0.05)。

由圖1可知，隨著保溫發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，醬醪中水分含量逐漸降低。含水量從最初的43.9%降低至成熟時(shí)的38.96%。造成含水量下降的原因有：其一，保溫發(fā)酵溫度通?？刂圃?8～45 ℃以實(shí)現(xiàn)大分子物質(zhì)的快速降解，高溫使得水分蒸發(fā)；其二，發(fā)酵過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)代謝及相關(guān)化學(xué)反應(yīng)會(huì)消耗一定的水分。

3.2 甜面醬保溫發(fā)酵過(guò)程中總酸與pH的變化情況

由于酸度直接影響酶活力，也會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)分布情況，從而影響物質(zhì)的代謝以及轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)上常會(huì)通過(guò)監(jiān)測(cè)發(fā)酵醬醪的酸度變化情況來(lái)調(diào)整溫度。甜面醬保溫發(fā)酵過(guò)程中總酸以及pH值的變化情況見(jiàn)圖2。

圖2 保溫發(fā)酵過(guò)程中總酸和pH的變化Fig.2 Changes of total acid and pH values at different insulation fermentation time

注：誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同小寫字母表示總酸含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示pH值差異顯著(P<0.05)。

由圖2可知，醬醪中總酸含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸上升，pH值則反之。保溫發(fā)酵0～20天，醬醪酸度快速上升，從0.67%上升到1.42%；同時(shí)，醬醪pH值則由5.7降低到4.9。發(fā)酵過(guò)程中，酸度的變化一方面源自于微生物發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸，另一方面則是由原料中蛋白質(zhì)降解生成的游離氨基酸帶來(lái)[12]。研究表明[13]：醬類發(fā)酵過(guò)程中，酸度的變化與乳酸菌的作用密切相關(guān)，發(fā)酵初期，乳酸菌快速繁殖同時(shí)大量產(chǎn)酸。保溫20～35天左右時(shí)，醬醪中的總酸含量約為1.48%(P>0.05)，醬醪pH值由4.9下降到4.33。保溫發(fā)酵35～60天，甜面醬中酸度變化幅度減緩，從1.48%上升到1.8%，增加了0.32%，較之于保溫前期酸度增加趨勢(shì)減慢，醬醪pH值由4.33下降到3.82。其原因可能是酸度的積累一定程度上會(huì)抑制產(chǎn)酸細(xì)菌的增長(zhǎng)，從而反饋調(diào)節(jié)酸度的增加，部分酸作為中間代謝物質(zhì)參與到其他化學(xué)反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為其他的物質(zhì)，從而使得酸度增加趨勢(shì)減緩。

3.3 甜面醬保溫發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量與淀粉酶活力的變化情況

甜面醬中還原糖主要來(lái)源于原料中淀粉等大分子物質(zhì)在淀粉酶等作用下水解生成糊精、麥芽糖以及葡萄糖等小分子物質(zhì)，進(jìn)而參與到酒精及乳酸發(fā)酵等多種化學(xué)反應(yīng)中。還原糖的含量可在一定程度上反映原料中糖類物質(zhì)的降解程度，還原糖含量與淀粉酶活力變化見(jiàn)圖3。

圖3 保溫發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量與淀粉酶活力的變化Fig.3 Changes of reducing sugar content and amylase activity at different insulation fermentation time

注：誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同小寫字母表示還原糖含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示淀粉酶活力差異顯著(P<0.05)。

由圖3可知，保溫發(fā)酵過(guò)程中，甜面醬中還原糖含量隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升直至穩(wěn)定，而淀粉酶的活力則逐漸下降。保溫發(fā)酵0～20天，還原糖含量由18.75%增加到25.65%，增幅達(dá)6.95%，該階段還原糖含量顯著增加(P<0.05)，淀粉酶活力從最初的158.99 U/g干基下降到61.29 U/g干基?？赡茉蛟谟冢喊棼}水初期，相對(duì)大的鹽含量及曲料拌和不均帶來(lái)的氧氣傳遞受阻等使得制曲階段所富集的霉菌在此階段生長(zhǎng)代謝受阻出現(xiàn)大量消亡，但其所分泌的糖化酶適于在中性及偏酸性的環(huán)境中發(fā)揮作用，pH值的適當(dāng)降低對(duì)糖化酶活影響不大，因此發(fā)酵前期糖化酶類繼續(xù)發(fā)揮作用，快速催化淀粉等多糖類物質(zhì)水解為小分子類還原糖，從而使得還原糖含量快速增加。保溫發(fā)酵20～40天，還原糖含量上升至27.3%，此階段增幅約為1.65%；保溫發(fā)酵40～60天，甜面醬中還原糖含量基本維持穩(wěn)定，約為27.3%(P>0.05)。結(jié)合數(shù)據(jù)分析可知，20天后，其含量增幅減小，原因可能在于：隨著發(fā)酵的進(jìn)行，原料中淀粉類物質(zhì)降解仍繼續(xù)，但水解生成的還原糖部分充當(dāng)碳源供微生物生長(zhǎng)代謝，同時(shí)部分還充當(dāng)?shù)孜飬⑴c到酒精、乳酸等發(fā)酵賦予甜面醬甜味，以及參與醬醪色素成分如氨基糖、焦糖等的合成，從而導(dǎo)致還原糖含量上升緩慢。

整個(gè)保溫發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量以及淀粉酶活力的變化情況表明，保溫發(fā)酵0～20天，此階段可以視為甜面醬中淀粉等大分子物質(zhì)快速降解的時(shí)期，此后還原糖含量雖然也有增加，但上升趨勢(shì)減緩，該研究結(jié)果與張靜等[14]的研究結(jié)果相一致。從淀粉類降解情況而言，保溫發(fā)酵20～40天，此階段甜面醬中的淀粉類大分子糖類物質(zhì)已經(jīng)最大程度地降解為還原糖類小分子，40天后隨著保溫發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行，其含量不再顯著性增加。綜上，保溫發(fā)酵20～40天后則可以終止保溫發(fā)酵階段，進(jìn)入曬露發(fā)酵階段。

3.4 甜面醬保溫發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量與蛋白酶活力的變化情況

添加鹽水進(jìn)行保溫發(fā)酵，此階段醬醪環(huán)境呈酸性(pH 4～5)，故保溫階段中主要考慮中性蛋白酶以及酸性蛋白酶的活力。氨基酸態(tài)氮主要源自于蛋白酶水解蛋白質(zhì)生成，其含量可反映蛋白質(zhì)的水解程度[15]。甜面醬保溫發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮與蛋白酶活力變化情況見(jiàn)圖4。

圖4 保溫發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮與蛋白酶活力的變化Fig.4 Changes of amino nitrogen content and protease activity at different insulation fermentation time

注：誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同小寫字母表示氨基酸態(tài)氮含量存在顯著性差異(P<0.05)；不同大寫字母表示酸性蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)；不同希臘字母表示中性蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)。

由圖4可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升，而兩種蛋白酶活力均快速降低。由于醬醪環(huán)境偏酸性，此條件下酸性蛋白酶活力高于中性蛋白酶活力。保溫發(fā)酵0～20天，醬醪中的氨基酸態(tài)氮含量從0.22%上升到0.37%，增加了0.15%，該階段氨基酸態(tài)氮含量顯著變化(P<0.05)。原因可能是制曲階段霉菌所分泌的蛋白酶在發(fā)酵前期起到水解蛋白的作用，中性蛋白酶將原料中的蛋白質(zhì)分解為不同大小的肽類，酸性蛋白酶作為一類肽酶則可進(jìn)一步將肽類降解為游離氨基酸[16]，從而使得前期氨基酸態(tài)氮的含量快速積累。保溫發(fā)酵20～40天，其含量從0.37%緩慢上升為0.39%，增幅較小，約為0.02%；保溫發(fā)酵40～60天，其含量則略有降低。通過(guò)多重比較分析各時(shí)期甜面醬中氨基酸態(tài)氮含量差異性可知，其含量在發(fā)酵前期及中期存在顯著性差異，發(fā)酵后期略有下降但基本維持穩(wěn)定。可能原因在于：發(fā)酵后期水分含量減少，高鹽以及偏酸的發(fā)酵環(huán)境使得蛋白酶的活力降低，同時(shí)一部分氨基酸經(jīng)脫羧、脫氨基后參與其他化合物的合成相關(guān)反應(yīng)中，消耗掉醬醪中的部分氨基酸，故導(dǎo)致其含量增幅較小。

從保溫發(fā)酵整個(gè)過(guò)程來(lái)看，保溫發(fā)酵0～20天，氨基酸態(tài)氮含量變化較大(P<0.05)，該階段為原料中蛋白質(zhì)的快速降解階段，隨著保溫進(jìn)行，氨基酸態(tài)氮含量亦有增加，但增加趨勢(shì)減緩。20～40天甜面醬中的蛋白質(zhì)最大程度地得到降解。發(fā)酵40天后，氨基酸態(tài)氮含量基本保持不變。結(jié)合保溫成本考慮，保溫發(fā)酵20～40天后則可以終止保溫發(fā)酵階段，進(jìn)入曬露發(fā)酵階段。

3.5 甜面醬保溫發(fā)酵過(guò)程中醬體感官變化情況

甜面醬發(fā)酵過(guò)程中，甜面醬的外觀形態(tài)變化一定程度上反映發(fā)酵進(jìn)行的程度。甜面醬保溫過(guò)程中感官變化情況見(jiàn)表1。

表1 保溫發(fā)酵過(guò)程中甜面醬的感官記錄Table 1 Sensory analysis records of sweet flour paste at different insulation fermentation time

由表1可知，醬體顏色與發(fā)酵時(shí)間呈正相關(guān)性；香氣則從發(fā)酵初期無(wú)明顯的香氣到后期醬香、酯香味突出；醬醪滋味隨著發(fā)酵進(jìn)行，甜、鮮味愈來(lái)愈強(qiáng)，咸味則是從拌入鹽水后就一直存在；醬醪體態(tài)在拌鹽水初期，存在較大面疙瘩，隨著發(fā)酵進(jìn)行，面團(tuán)逐漸減小，分散的小面團(tuán)使得醬醪整體呈現(xiàn)為較濃稠的狀態(tài)；發(fā)酵中后期，醬體出現(xiàn)大量氣孔分布；發(fā)酵終止時(shí)，氣孔消失，粘稠度適中。

甜面醬的感官形態(tài)變化與甜面醬發(fā)酵過(guò)程中的機(jī)理變化密切相關(guān)[17]。醬體顏色形成的可能原因有：葡萄糖α-羥基與氨基酸置換生成氨基糖，氨基糖作為醬體中色素組成，通常呈現(xiàn)棕紅色；同時(shí)，葡萄糖在高溫下脫水會(huì)形成焦糖，焦糖作為無(wú)定形的膠體物質(zhì)，呈棕紅色；原料分解的酪氨酸經(jīng)氧化作用生成黑色素，氨基酸與還原糖經(jīng)美拉德反應(yīng)生成類黑素；多酚類物質(zhì)在多酚氧化酶作用下也會(huì)生成黑色素。醬體的香氣主要得益于揮發(fā)性物質(zhì)的生成，通常為醇、醛、酸、酚類等物質(zhì)；各種醇類物質(zhì)又與醬中有機(jī)酸經(jīng)酯化反應(yīng)生成各種乙酯，酯類物質(zhì)通常具有芳香，為香氣來(lái)源之一[18]。咸味由拌入的食鹽水帶來(lái)，存在于整個(gè)發(fā)酵階段。甜、鮮味隨著發(fā)酵進(jìn)行而逐漸顯現(xiàn)，可能原因在于：原料中淀粉類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖、麥芽糖等，該類小分子還原糖產(chǎn)生明顯甜味，原料中蛋白質(zhì)經(jīng)曲霉蛋白酶降解為部分氨基酸呈現(xiàn)適度甜味；甜面醬的鮮味主要來(lái)源于小分子肽、核苷酸以及呈鮮味的氨基酸等[19]。隨著甜面醬趨于成熟，甜面醬滋味愈發(fā)爽口柔和，可能原因有：醬醪發(fā)酵過(guò)程中酒精發(fā)酵產(chǎn)生副產(chǎn)物甘油、高級(jí)醇等，此類物質(zhì)具有一定的呈味作用，同時(shí)作為酯化反應(yīng)的基礎(chǔ)物質(zhì)，使得醬體滋味爽口柔和[20]。在不同的發(fā)酵階段，甜面醬呈現(xiàn)不同的醬體狀態(tài)，發(fā)酵初期甜面醬由于制曲結(jié)束，面糕上分布有米曲霉等霉菌菌絲，部分結(jié)塊，經(jīng)拌鹽水入池后，有大塊團(tuán)狀的面糕分布在醬體中。隨著發(fā)酵進(jìn)行，原料中大分子物質(zhì)降解，大塊面團(tuán)逐漸呈小塊狀分布，此時(shí)醬醪略微干稠。發(fā)酵中期微生物產(chǎn)酸產(chǎn)氣作用明顯，使得醬醪中出現(xiàn)很多氣孔，到后期微生物出現(xiàn)消長(zhǎng)變化，發(fā)酵趨于結(jié)束時(shí)，醬體中氣孔消失，甜面醬均勻無(wú)雜質(zhì)。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)甜面醬保溫發(fā)酵過(guò)程中反映發(fā)酵狀況的相應(yīng)指標(biāo)分析研究，所得如下結(jié)論：

甜面醬保溫發(fā)酵過(guò)程中含水量從最初的43.9%降低至成熟時(shí)的38.96%；總酸含量由0.67%增加至結(jié)束時(shí)的1.8%。保溫發(fā)酵0～20天，醬醪中還原糖與氨基酸態(tài)氮含量快速增加，分別由18.75%，0.22%上升到25.65%，0.37%；20～40天，兩種物質(zhì)含量增加趨勢(shì)變緩，分別由25.65%，0.37%上升為27.3%，0.39%；40天之后，兩種物質(zhì)含量則基本維持穩(wěn)定。保溫發(fā)酵20～40天，此階段原料中淀粉及蛋白質(zhì)類大分子物質(zhì)得到最大程度的降解，此時(shí)的感官變化情況表明甜面醬尚未完全成熟，還需繼續(xù)發(fā)酵。因此，保溫發(fā)酵40天可達(dá)到保溫發(fā)酵快速降解原料中淀粉及蛋白質(zhì)類大分子物質(zhì)的目的。

通過(guò)對(duì)甜面醬保溫發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵機(jī)理的研究，可初步確定保溫發(fā)酵40天為保溫發(fā)酵階段結(jié)束的適宜階段，此時(shí)結(jié)束保溫發(fā)酵可進(jìn)入下一曬露發(fā)酵階段繼續(xù)發(fā)酵。但是，因確定的適宜的保溫發(fā)酵時(shí)間階段跨度較大，還需進(jìn)一步研究以明確保溫發(fā)酵終止的最佳時(shí)間。

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