藍尉冰，王帥靜，張義平，陳華磊，于鑰，黃雙霞，陳山,3*

(1.廣西大學(xué)， 南寧 530004；2.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，南寧 530004；3.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530004；4.欽州學(xué)院，廣西 欽州 535011)

右旋糖酐(Dextran)是蔗糖由腸膜明串珠菌發(fā)酵得到的產(chǎn)品，在化工、醫(yī)學(xué)、食品和化妝品等工業(yè)領(lǐng)域均有廣闊的應(yīng)用，如低熱右旋糖酐已使用在飲料、調(diào)味料等產(chǎn)品的生產(chǎn)。右旋糖酐可通過傳統(tǒng)發(fā)酵法和酶法這兩種方法合成。目前，右旋糖酐主要經(jīng)發(fā)酵法生產(chǎn)獲得，酶的生成和酶催化生成右旋糖酐同步進行，這個過程具有不可控制性，產(chǎn)量和品質(zhì)不穩(wěn)定。且后期需化學(xué)試劑酸進行降解后通過乙醇分級沉淀處理，所得產(chǎn)物分子量分散度廣，活性基團易被破壞，帶入有害成分，成本較高。酶法制備將酶的生成和酶誘導(dǎo)合成分開在不同的反應(yīng)器中進行，所得產(chǎn)物純度高，分子量分布均勻，酒精使用量少，降低了成本。用酶法獲得右旋糖酐與發(fā)酵法相比，其可連續(xù)化生產(chǎn)、雜質(zhì)含量低、產(chǎn)品分子量可調(diào)控等優(yōu)點，具有較為廣闊的應(yīng)用前景。但由于單酶合成所得的右旋糖酐分子量不易于控制，故本文以制備右旋糖酐為出發(fā)點，綜述了雙酶法定向合成右旋糖酐，為右旋糖酐的生產(chǎn)提供了新的理論支持。

1 雙酶法合成右旋糖酐的機理

右旋糖酐的酶法合成包括酶的制備及酶合成右旋糖酐兩部分，且此兩部分分別獨立進行。雙酶法是首先利用葡聚糖蔗糖合成酶合成相對分子量較大的右旋糖酐后加入分解酶分解得對應(yīng)目標(biāo)右旋糖酐。其機理主要是右旋糖酐蔗糖合成酶分子由1250～1600個差異的氨基酸構(gòu)成，其蛋白質(zhì)分子具由圖1所示的4個區(qū)域，其中A和B分別為信號肽段和可變區(qū)，C和D則是具有結(jié)合與分離蔗糖的N-末端催化區(qū)及具右旋糖酐鏈綁定的C-末端右旋糖酐聯(lián)結(jié)區(qū)。C是核心區(qū)，酶與蔗糖以共價鍵的形式結(jié)合且將蔗糖分解變?yōu)镈-glucosyl-Enzyme，此酶形成很關(guān)鍵；D區(qū)域聯(lián)結(jié)葡萄糖基，使得右旋糖酐鏈增長[1]。

圖1 右旋糖酐蔗糖酶的編碼基因圖Fig.1 The schematic structure of dextransucrase encoding genes

在酶催化的條件下，反應(yīng)可朝4種朝向進行：(a)D-葡萄糖基的遷移，是D-葡萄糖基局部要么被遷移到受體單糖要么到低聚糖里[2]；(b)蔗糖水解，是D-葡萄糖基部分被遷移到水中[3]；(c)D-葡萄糖基支鏈的形成或右旋糖酐鏈的轉(zhuǎn)移，一種可能是由部分D-葡萄糖基被遷移到右旋糖酐鏈，另一種可能是部分D-葡萄糖基隨右旋糖酐鏈遷到另一條糖酐鏈中；(d)聚合反應(yīng)終止，即右旋糖酐的釋放。由兩種可能：一種是右旋糖酐鏈遷移到水中，另一種是跟其他受體結(jié)合，這些受體包括蔗糖、D-果糖、D-葡萄糖、麥芽糖等。但是，右旋糖酐蔗糖合成酶的主要作用是通過催化作用合成右旋糖酐，催化原理見圖2。

圖2 右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐機理示意圖Fig.2 Schematic diagram of dextran synthesizing mechanism

注：○為葡萄糖，△為果糖，○-△為蔗糖，X1，X2為酶活性位點的親和團，○-○為由α-1，6糖苷鍵鏈接的葡萄糖基團。

右旋糖酐酶(Dextranase，酶的系統(tǒng)分類號為E.C.3.2.1.11)是一種分解酶，可隨機地切右旋糖酐中的α(1→6)糖苷鍵。右旋糖酐酶主要屬于糖苷水解酶家族GH 家族里，包括GH49，GH13，GH27，GH15，GH66家族，主要分有外切型和內(nèi)切型兩種。其中，GH13和GH15家族(如球形節(jié)桿菌右旋糖酐酶)屬于外切型，具有(α/α)6三維結(jié)構(gòu)。GH49和GH66家族(如口腔鏈球菌右旋糖酐酶)屬于內(nèi)切型，具有一種β螺旋結(jié)構(gòu)；GH27家族是一種α-1,6糖苷鍵被通過從非還原端降解放出異麥芽糖基元的異頭碳保留機制，是特殊家族。Larsson A M等[7]報道了微生物產(chǎn)右旋糖酐酶的晶體構(gòu)造并研究其催化作用機理，表明黃青霉產(chǎn)右旋糖酐酶主要有一個右手平行的β 螺旋結(jié)構(gòu)與 N末端的 β 夾層兩個結(jié)構(gòu)域，通過深入探索發(fā)現(xiàn)該酶的化學(xué)反應(yīng)有異頭碳反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，揭示了右旋糖酐酶存在一個單一的置換機理[4]。

2 雙酶法合成右旋糖酐的研究現(xiàn)狀

目前，也有通過酶法合成葡聚糖的報道，但僅限于單酶法較多。張洪斌等[5]通過研究發(fā)酵工藝獲得不同分子量的葡聚糖發(fā)酵工藝；王雅潔等[6]對重組大腸桿菌右旋糖酐蔗糖酶純化且做了酶學(xué)性質(zhì)相關(guān)研究。表明蔗糖既是該酶作用底物也是誘導(dǎo)劑，利用右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖所得葡聚糖粘性大，與酶纏繞難于分離。Berensmeier S等[7]對可應(yīng)用于流化床的固定化葡聚糖蔗糖酶進行了研究。Mohan R T J等[8]以蔗糖為底物，利用葡聚糖蔗糖酶制備葡聚糖，得到其最適條件為35 ℃，pH值5.4和5.0%(W/V)的蔗糖濃度。關(guān)于雙酶法合成右旋糖酐報道并不多見。姚日生等[9]用海藻酸鹽鞏固葡聚糖蔗糖酶提高該酶酶活并生產(chǎn)葡聚糖，通過加入右旋糖酐酶降解高分子量產(chǎn)物，并對酶的反應(yīng)條件進行的相關(guān)研究。有學(xué)者通過不同色譜法及循環(huán)超濾膜等方法研究雙酶作用，如Goulas A K等[10]對游離的DS與DN構(gòu)建的體系進行詳細研究，得出雙酶可調(diào)節(jié)右旋葡聚糖分子量大小，且低分子量的右旋葡聚糖的量會隨底物濃度及右旋糖酐酶量的增大而增加，但并未對合成規(guī)律和機制進行研究。2004年，Kubik C等學(xué)者[11]研究了右旋糖酐蔗糖酶酶活提高方法，運用已固定化了的右旋糖酐蔗糖酶協(xié)同未固定化的右旋糖酐酶制備多糖，結(jié)果表明經(jīng)戊二醛、海藻酸鈉固定化后可提高蔗糖利用率，但經(jīng)過多次利用，其轉(zhuǎn)化率降低。甘薇葦[12]用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶構(gòu)建雙酶體系制備右旋葡聚糖，得出蔗糖溶液雙酶催化反應(yīng)3 h，體系中果糖濃度已經(jīng)超過蔗糖，果糖峰面積占總體積的10.78%，抑制右旋葡聚糖生成。2008年，Erhardt F A等[13]研究共固定化雙酶體系合成低聚糖，發(fā)現(xiàn)已被海藻酸鈣固定化的右旋糖酐蔗糖酶共固定右旋糖酐酶后可以利用蔗糖為底物催化形成低分子量多糖。次年，具有右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶共同活力的融合酶誕生，其是由國外學(xué)者Kim Y M等[14]將來自不同菌株產(chǎn)的右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶基因片段以大腸桿菌為載體表達，此酶可利用蔗糖為底物聚合得到低聚糖，且相比于未融合的混合酶液，同等活力下，融合酶獲得的低聚糖產(chǎn)量更多，研究并指出可通過調(diào)節(jié)底物濃度調(diào)控低聚糖分子量分布，這項研究使雙酶合成右旋糖酐得到更進一步了解。而Oelcer等[15]將DSase酶與Dase酶共同固定化于海藻酸鈣凝膠中，將共固定化小球作用于底物蔗糖溶液，使得DSase酶催化蔗糖產(chǎn)生的右旋糖酐作為Dase酶的底物被降解，最后生成低聚糖。采用這種雙酶共同固定化方法，控制酶的配比及固體化小球與底物接觸反應(yīng)的時間，有可能得到目標(biāo)分子量的右旋糖酐產(chǎn)物。

3 雙酶法合成右旋糖酐產(chǎn)物檢測

目前對于酶法合成右旋糖酐，基于分子量不同的右旋糖酐其用途各不相同，故大部分研究屬于右旋糖酐分子量調(diào)節(jié)研究，故對右旋糖酐產(chǎn)物分子量檢測方法至關(guān)重要。多糖分子量的檢測技術(shù)有多種，包括端基分析法、滲透壓法、光散射法、粘度法、體積排阻色譜法等。其中，端基分析法、滲透壓法一般較適用于測定多糖物質(zhì)的數(shù)均分子量，而光散射法較適用于測定多糖物質(zhì)的重均分子量。 體積排阻色譜法(SEC)是各種色譜分離方法中最簡單的，其利用多孔凝膠固定相依據(jù)不同分子大小差異從而達到分離的方法。根據(jù)所用凝膠的性質(zhì)，可以分為使用水溶液的凝膠過濾色譜和使用有機溶劑的凝膠滲透色譜(gel酶、多糖等生物分子)。根據(jù)分子篩的原理，樣品組分在通過凝膠柱時，大分子物質(zhì)被凝膠孔洞阻止而最先被流動相淋洗出來；中分子物質(zhì)能夠進入固定相凝膠中的一些適合其大小的孔洞，在分離柱中滯留一定時間，較慢被流動相淋洗出來；而小分子物質(zhì)能夠進入凝膠中更微小的孔洞，在柱子中受到更長時間的滯留，而最后被流動相淋洗出來。采用體積排阻色譜法，可通過軟件直接得到樣品的數(shù)均分子量、D值、重均分子量等信息。

4 右旋糖酐應(yīng)用

右旋糖酐是由α-D-葡萄糖聚合而成的一種同多糖，因其具有很強的正旋光性，故又稱其為“右旋糖酐”。右旋糖酐是具有多種用途的多糖，其作用備受學(xué)者青睞。分子量分布較集中的低分子量右旋糖酐在臨床上是一種治療藥物，它常作為血漿擴容劑或血漿替代物，能夠提高失血過多患者的血容量，用于出血性及創(chuàng)傷性等休克事件的解決，還能改善血液微循環(huán)，預(yù)防或消除血管內(nèi)紅細胞聚集和血栓的形成等[16]，這也是推動右旋糖酐商品化最重要的一個因素。分子量約在1～10萬的右旋糖酐藥用價值巨大，其中Dex-20，Dex-40 以及Dex-70被中國藥典收錄[17]。由右旋糖酐誕生的其衍生物有廣泛的醫(yī)學(xué)用途，右旋糖酐鐵和右旋糖酐鋅能夠治療貧血癥和鋅缺乏癥，右旋糖酐硫酸酯具備近似于肝素的抗凝血功效，右旋糖酐因其具有一定的膠體特性和生物相溶性，還能夠作為藥物輔助材料或者是藥物輸送載體[18]。將純化后的大分子右旋糖酐與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)，再導(dǎo)入丙三醇側(cè)鏈，在右旋糖酐鏈間形成交聯(lián)鏈，所制得的交聯(lián)葡聚糖[19]具有廣闊的應(yīng)用價值。它在水中能溶脹卻不能溶解，交聯(lián)度越高，凝膠孔徑越小，常用于制備凝膠滲透色譜柱用來分離蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)，著名的商品化的交聯(lián)葡聚糖凝膠柱有Phamacia Fine Chemicals生產(chǎn)的Sephadex和Sephacryl。在食品工業(yè)，右旋糖酐可作為增稠劑被用在果醬、冰淇淋等食品，以提高食品的口感與風(fēng)味；低熱葡聚糖已被用于調(diào)味料、果醬的生產(chǎn)等[20]。

5 總結(jié)與展望

多糖是典型生物大分子，其生物功能逐漸引起學(xué)術(shù)界的重視。右旋糖酐以其特有性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、化工、食品等行業(yè)，是受關(guān)注的糖類之一。其傳統(tǒng)工藝是經(jīng)微生物發(fā)酵所得，分子量排布較廣，尤其中小分子量含量少，雜質(zhì)較多，粘度大，后期處理過程繁瑣。酶法合成多糖被認為是安全且有效的合成途徑，且酶法在溫和條件下通過向蔗糖底物添加右旋糖酐蔗糖酶就可合成右旋糖酐。但由于單酶合成取得的右旋糖酐分子量不易于控制。而雙酶體系因其可使底物轉(zhuǎn)化率高、促進合成、反應(yīng)快、產(chǎn)物分子量可調(diào)控等而成為制備多糖的熱門方法。其主要機理是在沒有其他受體的環(huán)境中，蔗糖底物被右旋糖酐蔗糖酶先催化生成D-葡萄糖基和果糖基，后D-葡萄糖基要么被遷移到水分子要么是右旋糖酐殘基C3/C6位置，水解蔗糖或聚合成右旋糖酐糖鏈。隨著反應(yīng)的進行，右旋糖酐慢慢增長形成大分子。通過添加右旋糖酐酶雙酶法可降解大分子右旋糖酐，獲得適合食品、藥品等廣泛價值的小分子量右旋糖酐。雙酶法在開發(fā)大幅減少或不使用有害化學(xué)試劑直接快速高效獲得藥用右旋糖酐的新技術(shù)起到協(xié)助作用。

[1]Monchois V,Willemot R M,Monsan P.Glucansucrases:mechanism of action and structure-function relationships[J].FEMS Microbiology Reviews,1999,23(2):131-151.

[2]Robyt J F,Eklund S H.Relative,quantitative effects of acceptors in the reation ofLeuconostocmesenteroidesB-512F dextransucrase[J].Carbohydrate Research,1983,121:279-286.

[3]Luzio G A,Mayer R M.The hydrolysis of sucrose by dextransucrase[J].Carbohydrate Research,1983,111(2):311-318.

[4]Larsson A M,Andersson R,Stahlberg J,et al.Dextranase fromPenicilliumminioluteum: reaction course,crystal structure,and product complex[J].Structure,2003,11(9):1111-1121.

[5]張洪斌,姚日生,朱慧霞,等.發(fā)酵法生產(chǎn)右旋糖酐的工藝研究[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2004,27(7):783-787.

[6]王雅潔，張洪斌，胡雪芹，等.重組大腸桿菌右旋糖酐蔗糖酶的純化及其性質(zhì)[J].微生物學(xué)報，2008，48(9)：1266-1269.

[7]Berensmeier S,Ergezinger M,Bohnet M,et al.Design of immobilised dextransucrase for fluidised bed application[J].Journal of Biotechnology,2004,114(3):255-267.

[8]Mohan R T J,Goyal A.Purification,optimization of assay,and stability studies of dextransucrase isolated fromWeissellacibariaJAG8[J].Preparative Biochemistry and Biotechnology,2013,43(4):329-341.

[9]姚日生,董明輝,朱慧霞.酶法合成右旋糖酐相對分子質(zhì)量的控制[J].精細化工,2007,24(10):964-967.

[10]Goulas A K,Fisher D A,Grimble G K,et al.Synthesis of isomaltooligosaccharides and oligodextrans by the combined use of dextransucrase and dextranase[J].Enzyme and Microbial Technology,2004,35(4):327-338.

[11]Kubik C,Sikora B,Bielecki S.Immobilization of dextransucrase and its use with soluble dextranase for glucooligosaccharides synthesis[J].Enzyme and Microbial Technology,2004,34(6):555-560.

[12]甘微葦.右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶協(xié)同催化制備低聚右旋糖酐與低聚糖的研究[D].合肥：合肥工業(yè)大學(xué),2014.

[13]Erhardt F A,Kugler J,Chakravarthula R R,et al.Co-immobilization of dextransucrase and dextranase for the facilitated synthesis of isomalto-oligosaccharides: preparation,characterization and modeling[J].Biotechnology and Bioengineering,2008,100(4):673-683.

[14]Kim Y M,Seo M Y,Kang H K,et al.Construction of a fusion enzyme of dextransucrase and dextranase: application for one-step synthesis of isomalto-oligosaccharides[J].Enzyme and Microbial Technology,2009,44(3):159-164.

[15]Oelcer Z,Tanriseven A.Co-immobilization of dextransucrase and dextranase in alginate[J].Process Biochemistry (Amsterdam,Netherlands),2010,45(10):1645-1651.

[16]Tam S C,Blumenstein J,Wong J T.Soluble dextran-hemoglobin complex as a potential blood substitute[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1976,73(6):2128-2131.

[17]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010版，二部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：111-117.

[18]Krol A,Dewhirst M W,Yuan F.Effects of cell damage and glycosaminoglycan degradation on available extravascular space of different dextrans in a rat fibrosarcoma[J].International Journal of Hyperthermia,2003,19(2):154-164.

[19]Tomme S R,Nostrum C F,Smedt S C,et al.Degradation behavior of dextran hydrogels composed of positively and negatively charged microspheres[J].Biomaterials,2006,27(22):4141-4148.

[20]宋少云,廖威.葡聚糖的研究進展[J].中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2005,44(s2):229-232.