杜小燕，李長龍，王冬平，陳振文*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069； 2. 軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071)

糖尿病是一個(gè)全球性健康問題，同樣也威脅著中國人的健康，中國患糖尿病人數(shù)居全球首位，且患病率達(dá)成年人口的11.6%[1-2]。Ⅱ型糖尿病是最常見的糖尿病類型之一，占糖尿病總?cè)藬?shù)的90%以上[3]，其發(fā)病特征為胰島素抵抗[4]。研究糖尿病機(jī)制和治療靶點(diǎn)離不開動(dòng)物模型?，F(xiàn)有的糖尿病動(dòng)物模型主要包括自發(fā)型、實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)型以及基因修飾型小鼠、大鼠以及小型豬等多種類型[5-6]。自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型由于其自身的環(huán)境和遺傳因素共同作用使之成為最理想且最具應(yīng)用價(jià)值的一類模型，但是這類模型由于種類少，受所有權(quán)或價(jià)格等一系列因素的限制而不易獲得。

長爪沙鼠是源自我國的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，后傳到日本和歐美等國家，因其腦底動(dòng)脈Willis環(huán)、前列腺、眼、耳等具有獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)及其對(duì)微生物易感性、多種腫瘤易發(fā)等生理和行為學(xué)特征，已廣泛地應(yīng)用于腦神經(jīng)、寄生蟲病、微生物、生殖、內(nèi)分泌、營養(yǎng)、代謝及藥理、腫瘤等諸多領(lǐng)域研究，被稱為“多功能”實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[7]。長爪沙鼠作為一個(gè)潛在的糖尿病動(dòng)物模型，早在1972年Boquist報(bào)道[8]發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠群體中具有高血糖和肥胖特征動(dòng)物個(gè)體，但是符合高血糖特性的動(dòng)物比例較低(7.14%)。我們課題組在進(jìn)行長爪沙鼠近交系培育過程中，在近交培育至F7代時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)分支具有高血糖的特性，發(fā)生比例(21.33%)顯著高于Boquist的報(bào)道，經(jīng)過3代定向篩選后其發(fā)病率隨培育代數(shù)逐步提高，證明該動(dòng)物糖尿病的發(fā)生具有遺傳性。在此基礎(chǔ)上，我們團(tuán)隊(duì)通過長達(dá)8年的定向培育，成功培育到F20代，形成了一個(gè)自發(fā)性糖尿病長爪沙鼠模型品系，于2017年12月通過了專家鑒定為新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系。本文將近年來圍繞糖尿病長爪沙鼠群體的生物學(xué)特性和發(fā)病機(jī)制的一系列研究結(jié)果進(jìn)行概述。

1 定向培育長爪沙鼠糖尿病模型近交系

采用快速血糖儀檢測成年長爪沙鼠空腹血糖(FPG)和口服葡萄糖耐量(PG2h)，將Boquist 報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)(FPG > 4.8 mmol/L和PG2h > 6.6 mmol/L)略有提高，以FPG > 5.2 mmol/L和PG2h > 6.8 mmol/L兩個(gè)指標(biāo)篩選同窩動(dòng)物進(jìn)行近親繁殖，共檢測了2200多只動(dòng)物，隨著這種定向篩選，F(xiàn)PG > 5.2 mmol/L動(dòng)物從最初F7的41.33%上升到F20的 100%；PG2h > 6.8 mmol/L動(dòng)物從F7的38.67%上升到F20的60%，兩者都符合糖尿病標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物從F7的21.33%上升到F20的60%，實(shí)現(xiàn)了定向培育自發(fā)糖尿病模型近交系的目標(biāo)。通過對(duì)其繁殖性能的分析發(fā)現(xiàn)，其出生重(4.05±1.64)g，離乳重(32.49±5.99)g，略高于腦缺血近交系長爪沙鼠，但是胎間隔和胎仔數(shù)略低[9]，目前保有種子動(dòng)物80余對(duì)。

2 長爪沙鼠糖尿病模型近交系生物學(xué)特性

2.1 不同年齡糖尿病長爪沙鼠空腹血糖(FPG)和膽固醇水平

為研究該近交系動(dòng)物生理生化指標(biāo)特點(diǎn)及其與年齡的相關(guān)性，我們檢測了12月齡、15月齡、18月齡、21月齡和24月齡及以上月齡的沙鼠血清中FPG和膽固醇水平，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，1歲以上空腹血糖水平逐步升高(4.94，6.15，6.90，5.21，6.27 mmol/L)，但膽固醇在不同年齡段無明顯改變(3.77，3.71，4.84，4.00，3.67 mmol/L)。說明年齡對(duì)血糖的影響更大。

2.2 長爪沙鼠糖尿病近交系血液生化指標(biāo)、脂肪因子和采食量水平

采用自動(dòng)生化分析儀檢測了血糖、三酰甘油、高密度脂蛋白和膽固醇，用ELISA檢測了insulin、adiponectin和leptin，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment for insulin resistance, HOMA-IR)。結(jié)果顯示，高血糖動(dòng)物3月齡時(shí)與正常血糖動(dòng)物相比葡萄糖耐量顯著受損，insulin(13.61±8.03 vs 232.58±95.09) μU/mL、HOMA-IR(4.37±2.98 vs 70.17±31.32)、leptin(288.29±146.25 vs 22080.41±7346.33) pg/mL、空腹血糖(4.54±0.94 vs 9.02±2.40) mmol/L、三酰甘油(0.52±0.33 vs 4.47±4.06) mmol/L和膽固醇(2.52±0.33 vs 5.87±2.44) mmol/L在糖尿病動(dòng)物中顯著升高，而血清adiponectin(23.75±4.64 vs 10.65±3.93) μg/mL水平下降。對(duì)該近交系動(dòng)物進(jìn)行胰島素耐量檢測的結(jié)果顯示，糖尿病組動(dòng)物胰島素敏感性顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了該模型近交系為Ⅱ型糖尿病模型。但對(duì)同年齡段糖尿病動(dòng)物和對(duì)照組動(dòng)物每天攝食量檢測后發(fā)現(xiàn)，二者采食量差異無顯著性(5.40±1.40 vs 4.86±1.86) g。這些結(jié)果說明該近交系表現(xiàn)出明顯的瘦素抵抗，瘦素血清水平的升高與體脂和肥胖直接關(guān)聯(lián)，對(duì)體重調(diào)節(jié)、能量消耗、食欲和進(jìn)食等有重要作用，對(duì)保持肥胖特征和體重非常關(guān)鍵[10-11]。脂聯(lián)素的檢測結(jié)果進(jìn)一步說明其降低常與胰島素抵抗、肥胖和Ⅱ型糖尿病相關(guān)[12]。但根據(jù)采食量檢測結(jié)果推斷長爪沙鼠糖尿病動(dòng)物的發(fā)病不是由增加食物攝取導(dǎo)致的。

3 糖尿病長爪沙鼠胰腺、肝、腎和肌肉組織病理學(xué)變化

Ⅱ型糖尿病患者常伴有并發(fā)癥的發(fā)生，比如肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)和眼部并發(fā)癥[12-13]。我們對(duì)糖尿病長爪沙鼠進(jìn)行了病理形態(tài)學(xué)檢測，HE染色結(jié)果顯示，在糖尿病長爪沙鼠胰腺、肝和腎中均出現(xiàn)不同程度的病變。肝發(fā)生明顯脂肪變性和局灶性壞死。腎在低倍鏡下可見腎被膜完整，腎小管結(jié)構(gòu)清晰，小管內(nèi)偶見粉染蛋白樣物質(zhì)，可見個(gè)別腎小球發(fā)生固縮。高倍鏡下，固縮的腎小球體積變小，著色加深，毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)不清晰；部分腎小管上細(xì)胞腫脹，細(xì)胞界限不清晰，有的脫落到管腔中，部分細(xì)胞核固縮、碎裂、溶解至消失；間質(zhì)疏松、水腫，局部血管充血、出血。胰腺出現(xiàn)局部壞死現(xiàn)象。對(duì)肝組織的電鏡觀察結(jié)果顯示，糖尿病動(dòng)物肝組織細(xì)胞內(nèi)脂滴顯著增多，有明顯的肝脂肪變性，且可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張和脫顆?；约熬€粒體腫脹。這些結(jié)果說明糖尿病沙鼠的肝、腎和胰腺均發(fā)生一定程度的組織損傷病變，并可能繼發(fā)于慢性糖尿病。

4 長爪沙鼠糖尿病發(fā)生的分子機(jī)制初探

4.1 糖尿病相關(guān)候選基因的克隆與同源性分析

為了研究該長爪沙鼠糖尿病發(fā)生的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，我們進(jìn)行了糖尿病相關(guān)候選基因的研究。用3’/5’RACE法克隆了長爪沙鼠Glut4、Leptin、Adiponectin、Akt和CAPN10基因的全長cDNA序列，其全長cDNA序列分別為1486 bp、634 bp、1169 bp、2363 bp和2467 bp，并在GenBank中注冊(cè)，分別為Glut4(KT377191)、Akt(KT377189)、Leptin(KT377190)、Adiponectin(KT377188)、CAPN10(KT377192)。我們對(duì)5個(gè)候選基因序列與小鼠、大鼠和人進(jìn)行同源性分析并繪制了進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)Glut4(88.6%、91.4%和91.2%)、Leptin(80.4%、87.5%和87.1%)、Adiponectin(81.2%、90.1%和87.5%)、Akt和CAPN10(83.9%、90.1%和87.5%)的cDNA序列與大鼠、小鼠和人具有高度同源性，其中Akt表現(xiàn)出最高同源性(在人、小鼠和大鼠中分別為91.0%、90.9%和96.1%)；Leptin(78.7%、85.8%和84.6%)、Adiponectin(84.1%、93.1%和88.6%)、Akt(98.1%、99.4%和99.6)和CAPN10(81.1%、93.4%和92.8%)的蛋白序列與大鼠、小鼠和人也表現(xiàn)出了高度的相似性，而Glut4的同源性較低(在人、小鼠和大鼠中分別為24.5%、24.0%和23.8%)。

4.2 長爪沙鼠胰腺、肌肉、肝和腎等組織中候選基因的表達(dá)水平

為深入了解該模型動(dòng)物糖尿病發(fā)生機(jī)制，我們用免疫組化方法對(duì)克隆的5個(gè)候選基因在腎、胰腺、肝、脂肪和肌肉中的表達(dá)水平進(jìn)行了測試。結(jié)果顯示，在糖尿病動(dòng)物腎和胰腺組織中Adiponectin的表達(dá)均明顯降低；Glut4在腎組織中表達(dá)下降；Akt在腎中表達(dá)下降。為進(jìn)一步判定發(fā)生胰島素抵抗的器官或組織，分析該模型動(dòng)物糖尿病相關(guān)基因的表達(dá)差異和遺傳特征，分析其可能的調(diào)控途徑和它們之間的關(guān)聯(lián)，我們又運(yùn)用Realtime-PCR和Western blot方法對(duì)這5個(gè)基因在胰腺、肌肉、肝、腎和脂肪5種組織中的mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行了分析。Western blot結(jié)果顯示，糖尿病動(dòng)物在肌肉組織中Leptin表達(dá)升高，而Adiponectin表達(dá)下降；Realtime-PCR結(jié)果顯示，肌肉組織中adiponectin表達(dá)下降，CAPN10表達(dá)有下降趨勢。

有研究報(bào)道稱脂聯(lián)素是一種增加葡萄糖吸收的脂肪因子，肌肉組織是其靶器官[14]，可通過AMP依賴性蛋白激酶途徑刺激葡萄糖吸收和脂肪酸氧化，從而導(dǎo)致血清膽固醇升高[15]?？茖W(xué)家研究發(fā)現(xiàn)瘦素也可以通過AMPK途徑調(diào)節(jié)脂肪酸氧化[16]。脂聯(lián)素也可以在血中胰島素水平降低狀態(tài)下通過保存脂肪組織質(zhì)量調(diào)節(jié)瘦素水平[17]。在肝中，adiponectin通過脂聯(lián)素受體1(adipoR1)激活A(yù)MPK和PPARα從而降低肝脂肪生成和增加β氧化[18]。在腎中，adiponectin與受體結(jié)合激活A(yù)MPK，從而保護(hù)腎不受高脂飼料誘導(dǎo)的影響[19]。我們的結(jié)果也顯示，兩種基因在腎或肌肉中的表達(dá)與對(duì)照不同，表明瘦素和脂聯(lián)素參與了長爪沙鼠Ⅱ型糖尿病的發(fā)生。另外我們還檢測了CAPN10基因，其在骨骼肌中mRNA表達(dá)呈下降趨勢，這與報(bào)道CAPN10參與葡萄糖代謝并在骨骼肌中表達(dá)呈下降趨勢一致[20-21]，說明長爪沙鼠糖尿病的發(fā)生和CAPN10有關(guān)，也進(jìn)一步證明骨骼肌可能是長爪沙鼠糖尿病發(fā)病的一個(gè)主要靶器官。

5 發(fā)現(xiàn)了肥胖型和非肥胖型糖尿病長爪沙鼠模型群體

臨床數(shù)據(jù)顯示，糖尿病患者具有肥胖和非肥胖兩種類型[22]，同樣健康個(gè)體也有肥胖和非肥胖之分[23]。我們?cè)谔悄虿〗幌档呐嘤行疫\(yùn)地發(fā)現(xiàn)糖尿病長爪沙鼠也具有類似特征，根據(jù)體重范圍將成年體重60 ～ 75 g之間的動(dòng)物定義為非肥胖動(dòng)物，≥94 g的成年動(dòng)物定義為肥胖動(dòng)物；選取1 ～ 1.5歲的動(dòng)物進(jìn)行MRI、葡萄糖耐量、胰島素耐量和胰島素釋放的檢測，根據(jù)體重和血糖將沙鼠分為non-obesity non-diabetes (NOND)、obesity non-diabetes (OND)、non-obesity diabetes (NOD)和obesity diabetes (OD)共4組，各組體重結(jié)果顯示，OND和OD組體重顯著高于NOND和NOD組(超出55.6%)，MRI檢測NOND、OND、NOD和OD各組脂肪分布的結(jié)果說明，OND和OD組相對(duì)脂肪面積遠(yuǎn)高于NOND和NOD組。對(duì)4組動(dòng)物進(jìn)行葡萄糖耐量、胰島素耐量和胰島素釋放量的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OND組葡萄糖耐量正常、胰島素耐量受損和胰島素釋放正常；NOD組葡萄糖耐量受損、胰島素耐量正常而胰島素釋放增加；OD組葡萄糖耐量受損、胰島素耐量受損且胰島素釋放增加，這些結(jié)果和我們對(duì)臨床病人分組檢測的結(jié)果非常相似，也和臨床報(bào)道一致，即消瘦型糖尿病不存在向心性肥胖所以不存在胰島素抵抗，同樣在消瘦型糖尿病中脂肪分布也發(fā)生改變[24]，肥胖糖尿病個(gè)體有更嚴(yán)重的異位和內(nèi)臟脂肪堆積，且胰島素抵抗較嚴(yán)重[25]。

6 長爪沙鼠NOND、OND、NOD和OD型動(dòng)物各部位脂肪組織分布和細(xì)胞體積變化

利用動(dòng)物模型的優(yōu)勢，我們收集了皮下脂肪、性腺周圍脂肪、腎周圍脂肪、腸系膜脂肪和胰腺脂肪進(jìn)行稱重，計(jì)算不同部位脂肪占體重或總脂肪的百分比，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)整體為肥胖動(dòng)物即OND和OD組總脂肪和不同部位脂肪重量增加，而NOD組皮下和腎周圍脂肪與NOND組相比顯著增加；各部位脂肪占體重的百分比與各部位脂肪重量結(jié)果趨勢相一致；但是各部位脂肪量和總脂肪量比值則發(fā)生了改變，皮下脂肪/總脂肪量比在2個(gè)肥胖組(OND和OD組)顯著低于2個(gè)正常體重組，腎周脂肪占總脂肪量比在3個(gè)疾病組均稍高于正常對(duì)照組，而性腺周圍脂肪在OND和OD組占總脂肪的百分比下降。這說明皮下脂肪在肥胖時(shí)對(duì)總脂肪量的貢獻(xiàn)率顯著降低，而腎周脂肪與疾病的出現(xiàn)有關(guān)。

用HE染色方法對(duì)NOND、OND、NOD和OD 4組動(dòng)物皮下、性腺和腎周脂肪細(xì)胞大小進(jìn)行檢測。Image J分析結(jié)果顯示，肥胖個(gè)體即OND和OD組皮下、性腺周圍和腎周圍脂肪細(xì)胞大小均增加，且與NOND和NOD相比具有顯著差異。皮下和腎周圍脂肪細(xì)胞大小在NOD組中與NOND相比具有增大趨勢(HE結(jié)果)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有報(bào)道認(rèn)為成年時(shí)期機(jī)體脂肪細(xì)胞數(shù)量是固定的，即使是在肥胖狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞的總量在兒童和青少年期被確定，因此兒童期根據(jù)機(jī)體的需要可能是總數(shù)量改變的唯一機(jī)會(huì)[26]。這些結(jié)果說明，肥胖組無論是否糖尿病，其各部位脂肪量增加和脂肪擴(kuò)張的原因主要是各部位脂肪細(xì)胞增大導(dǎo)致的。也進(jìn)一步驗(yàn)證了肥胖組動(dòng)物總的和不同部位脂肪重量增加，NOD組皮下和腎周圍脂肪與NOND組相比增加。

7 結(jié)語

筆者團(tuán)隊(duì)培育出的自發(fā)性長爪沙鼠糖尿病模型近交系，已確定其為Ⅱ型糖尿病。它不但豐富了我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，同時(shí)為糖尿病這一全球重大疾病的研究提供了寶貴的動(dòng)物模型資源。尤其是肥胖和非肥胖糖尿病長爪沙鼠的發(fā)現(xiàn)和亞型分類，為研究人類肥胖、非肥胖糖尿病和肥胖糖尿病的機(jī)制與藥物開發(fā)提供良好模型材料，必將推動(dòng)糖尿病發(fā)病機(jī)制研究、藥物研發(fā)和評(píng)價(jià)以及臨床不同亞型糖尿病的精準(zhǔn)治療研究的進(jìn)程。