施蕾，林潔平，廖淑珍，招春飛，劉華鋒，潘慶軍

(湛江市慢性腎臟病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎臟疾病研究所，廣東 湛江 524001)

抗體是B淋巴細(xì)胞經(jīng)抗原刺激而增殖分化為漿細(xì)胞后所產(chǎn)生的一種糖蛋白，主要介導(dǎo)體液免疫。單一B淋巴細(xì)胞系只產(chǎn)生針對一種特異性抗原決定簇的抗體，即單克隆抗體(簡稱單抗，monoclonal antibodies，mAbs)[1]。單抗具有結(jié)構(gòu)均一、純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、交叉反應(yīng)少、制備成本低等優(yōu)點(diǎn)。其生物學(xué)功能主要有[2]：(1)與抗原結(jié)合后募集免疫分子，如補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)等；(2)阻斷配體-受體相互作用或引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如誘導(dǎo)凋亡，這種機(jī)制主要依賴于其與抗原(配體或受體)結(jié)合功能。當(dāng)前，40多種單抗已被批準(zhǔn)使用于臨床治療自身免疫性疾病、腫瘤和移植等，且有大量的單抗正在研發(fā)[3]。

1 全人源單抗的制備技術(shù)

1.1 人源化小鼠

1975年Kohler和Milstein[4]通過小鼠雜交瘤技術(shù)獲得了單抗。鼠源單抗會(huì)誘發(fā)患者機(jī)體的免疫應(yīng)答，使其被快速清除，故治療效果較差。人源性單抗可減少鼠基因序列引起的免疫反應(yīng)，提高治療的效能及安全性[5]。隨后開啟了人源化單抗制備的歷史。1977年，Abgenix公司(美國)使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備出含人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(XenoMouse)[6]。2001年，Karpas等[7]從人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中篩選出一株細(xì)胞株，其能在體外保持穩(wěn)定的擴(kuò)增能力，被命名為Karpas707細(xì)胞，擬用于融合人B細(xì)胞，進(jìn)而制備全人源單抗，但至今相關(guān)報(bào)道甚少。全人源單抗作為一個(gè)新興技術(shù)正處于上升期，受到國內(nèi)外醫(yī)藥領(lǐng)域研究者廣泛關(guān)注[8]。據(jù)報(bào)道，與抗體庫平臺(tái)技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)技術(shù)在開發(fā)全人源抗體中更具優(yōu)勢，成為目前最具有優(yōu)勢的抗體藥物研發(fā)平臺(tái)。Medarex公司(隸屬于百時(shí)美施貴寶)的 HuMAb-MouseTM與Abgenix公司(隸屬于安進(jìn))的XenoMouse技術(shù)是目前最為成熟的轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)。在此基礎(chǔ)上，Regeneron 的科學(xué)家設(shè)計(jì)了VelocImmuneTMmouse技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行抗體藥物的篩選，并且在此平臺(tái)上進(jìn)一步構(gòu)建了“共有輕鏈小鼠”(common light chain mouse)，利用這種小鼠產(chǎn)生的抗體的親和力較高[9]。但產(chǎn)生全人源單抗的轉(zhuǎn)基因小鼠的研發(fā)周期長，需要投入巨額的研發(fā)基金，迄今為止國內(nèi)的轉(zhuǎn)基因小鼠核心技術(shù)平臺(tái)較少。目前，已有數(shù)種全人源單抗制備技術(shù)[10]。與此同時(shí)，針對治療性單抗的改造可增強(qiáng)其治療的安全性和有效性，如優(yōu)化單抗親和力成熟、改變單抗糖基化水平等。

1.2 噬菌體展示技術(shù)

1985年，Smith[11]第一次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因III，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)。隨后，Scott等[12]提出表面展示系統(tǒng)，Chiswell等[13]在此基礎(chǔ)上提出了噬菌體展示系統(tǒng)。此后30年間，研究者們在微流體噬菌體展示技術(shù)(microuidic-based phage display)的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步研究開發(fā)，使其具有簡單、高效和低廉的優(yōu)點(diǎn)[14]。噬菌體展示技術(shù)用于單抗的制備，僅需獲得免疫球蛋白的基因序列，即可制備相應(yīng)的抗體片段[15]；因此，可快速篩選單抗，避免了傳統(tǒng)雜交瘤方法的限制性和周期長等問題。根據(jù)使用的噬菌體類型不同，噬菌體展示系統(tǒng)被分為：絲狀(M13)噬菌體展示系統(tǒng)[16]、T7噬菌體展示系統(tǒng)[17]、lambda[18]或T4[19]噬菌體展示系統(tǒng)。目前，噬菌體抗體庫技術(shù)已經(jīng)十分成熟，可篩選出高特異性、親和力強(qiáng)的抗體基因序列，進(jìn)而制備全人源抗體。如雅培公司研發(fā)的抗腫瘤壞死因子(TNF)全人單抗Humira(修樂美)，用于治療關(guān)節(jié)炎等[10]。

1.3 酵母展示技術(shù)

1997年，Boder與Wittrup[20]首次建立酵母展示系統(tǒng)，并且用遺傳學(xué)方法改進(jìn)酵母菌株。酵母展示技術(shù)提高了細(xì)胞表面蛋白結(jié)合的親和力和穩(wěn)定性，最先使用于抗體的親和力成熟[20-21]。與噬菌體相比，酵母的顆粒足夠大，以致其可以使用流式細(xì)胞技術(shù)和熒光激活細(xì)胞分選進(jìn)行篩選和分離[22]。大多數(shù)酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)運(yùn)用經(jīng)典的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定蛋白、凝集素和絮凝劑[23]。酵母展示系統(tǒng)常被用于scFv庫、Fab庫、IgG庫及ZZ結(jié)構(gòu)域等抗體庫的構(gòu)建[24]。

1.4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞是表達(dá)具有天然活性蛋白的重要宿主，Akamatsu等[25]利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行抗體的展示及篩選，從而獲得特異性抗體。中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)細(xì)胞是用于真核基因表達(dá)的最成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，是目前在生物工程上廣泛使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞[26]。與噬菌體展示技術(shù)相比，外源蛋白更易在CHO細(xì)胞中合成并且分泌到培養(yǎng)基；重組蛋白能夠正確折疊、修飾、組裝多亞基蛋白并且其理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)幾乎與天然蛋白相似[27]。但外源基因在CHO表達(dá)系統(tǒng)中比在酵母展示系統(tǒng)中的表達(dá)效率低且重組蛋白的生產(chǎn)成本高，故通過改進(jìn)CHO細(xì)胞表達(dá)技術(shù)，如調(diào)控表達(dá)技術(shù)、優(yōu)化載體和基因、改造宿主細(xì)胞等，從而提高外源基因的表達(dá)效率，這在生物技術(shù)的發(fā)展中具有很高的應(yīng)用價(jià)值[28]。

1.5 單個(gè)B細(xì)胞分選技術(shù)

近年，單個(gè)細(xì)胞分選技術(shù)引起廣泛關(guān)注。Hu等[29]用CD19、IgG和HA特異性BCR標(biāo)記聯(lián)合篩選抗原特異性記憶B細(xì)胞，該技術(shù)有效地增加了高親和力抗原特異性全人源單抗的獲取。Smith等[30]發(fā)現(xiàn)了一種快速制備全人源單抗的方法，即將單細(xì)胞RT-PCR與嵌套式PCR組合獲取抗體的基因信息。與噬菌體展示相比，該方法可提高抗體的有效性和產(chǎn)量。目前，基于該技術(shù)已制備出抗流感、抗炭疽病毒和抗肺炎球菌全人源抗體。另外，Nogales-Gadea等[31]運(yùn)用一種更簡單、可直接制備全人源單抗的技術(shù)即，運(yùn)用EB病毒感染人記憶B細(xì)胞同時(shí)加入Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)激動(dòng)劑的方法，制備全人源單抗：首先，分離外周血PBMC，運(yùn)用分選技術(shù)獲得B細(xì)胞，再用EB病毒感染使之永生化，在感染過程中加入TLR9激動(dòng)劑激活，持續(xù)培養(yǎng)后，篩選最優(yōu)活性的B細(xì)胞，隨后運(yùn)用PCR技術(shù)進(jìn)行測序和克隆[32]。

近年來，研究者們運(yùn)用微流體PCR和DNA測序技術(shù)可從大量細(xì)胞中分析單個(gè)細(xì)胞，Ramsk?ld等[33-34]開發(fā)出一種的Smart-Seq基因測序法，可顯著改善轉(zhuǎn)錄組的覆蓋范圍，精確分析臨床相關(guān)單細(xì)胞中的基因表達(dá)情況?；诖思夹g(shù)，Picelli等[35]開發(fā)出與Smart-seq相比更經(jīng)濟(jì)、高效的Smart-seq2技術(shù)[36]。

目前，單細(xì)胞抗體納米孔(SCAN)技術(shù)是第一個(gè)能夠定量單個(gè)B細(xì)胞分泌抗體水平的技術(shù)，可直接檢測分泌的自身抗體，明確其抗原特異性和產(chǎn)生自身抗體的細(xì)胞，具有高通量、高敏感性和高特異性。Esfandiary等[37]運(yùn)用SCAN技術(shù)檢測來自單個(gè)B細(xì)胞的同型特異性抗SSA/Ro60和抗SSB/La的自身抗體，并可定量B細(xì)胞分泌兩種抗體的水平。

2 全人源單抗的改造策略

當(dāng)前，市售治療性單抗多屬于IgG類(IgG1和某些IgG2和IgG4亞型)。IgG其發(fā)揮功能主要依賴Fab段的抗體中和作用、Fc介導(dǎo)的補(bǔ)體激活作用(誘發(fā)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用，CDC)、活化的FcγR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)誘導(dǎo)ADCC以及新生兒Fc受體(FcRn)介導(dǎo)的半衰期改變等。人IgG以重鏈的差異(γ1、γ2、γ3、γ4)分為4個(gè)亞型：IgG1(60% ～ 70%)、IgG2(15% ～ 20%)、IgG3(5% ～ 10%)、IgG4(4% ～ 6%)。目前，研究者們通過以下幾個(gè)方面對單抗的療效進(jìn)行優(yōu)化。

2.1 親和力成熟

通過優(yōu)化單抗的親和力，能相應(yīng)地提高單抗的有效性，減少其不良反應(yīng)。研究者將一些構(gòu)建抗體庫的方法應(yīng)用到抗體庫技術(shù)中以便產(chǎn)生更大庫容量的突變抗體庫，或模擬體內(nèi)親和力成熟的顯著突變或熱點(diǎn)突變基因構(gòu)建小容量庫，從而篩選出高親和力的特異性抗體[2, 38]。

2.2 糖基化修飾

糖基化修飾在抗體的功能調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[39]。大部分IgG分子僅在每個(gè)Fcγ2區(qū)域Asn-297存在一個(gè)保守的N-糖基化修飾位點(diǎn)，約20%在IgG可變區(qū)有第二個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，所有位點(diǎn)都位于重鏈[40]。糖基化能夠影響Fc段的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，而Fc 糖基化修飾能夠調(diào)節(jié) IgG 的效應(yīng)功能，包括ADCC、CDC以及半衰期。因此，IgG的Fc糖鏈對抗體與各種受體的最佳結(jié)合、抗體對病原體的有效清除，以及治療性抗體的臨床應(yīng)用都是必不可少的[41]。

正常人IgG的Fc寡糖主要為核心巖藻糖基化的復(fù)雜雙天線型，多因?yàn)槟┒颂堑陌肴樘腔屯僖核峄a(chǎn)生異質(zhì)性。核心巖藻糖缺失可顯著增強(qiáng)IgG的ADCC，原因在于核心巖藻糖基化缺失的抗體與FcγRIIIA的親和力顯著增強(qiáng)[42]。但在一些治療應(yīng)用上，減少或消除ADCC活性也是必要的。Gong等[43]發(fā)現(xiàn)抗-CD20單抗，IgG4非巖藻糖基化水平 < 30%，IgG4抗體與其受體的結(jié)合力是最弱的。這表明，非巖藻糖基化IgG4能夠降低其效應(yīng)功能，增加單抗的治療效果。末端半乳糖基化也顯著影響IgG功能，半乳糖殘基的缺失與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病相關(guān)[44]，Liu等[45]認(rèn)為在單抗中較低水平的末端半乳糖能夠降低CDC活性。末端唾液酸化在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的單抗主要有兩種類型：N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)和N-羥乙基神經(jīng)氨酸(NeuAc), 后者是人類唾液酸的形式。Scallon和Anthony等[46-47]發(fā)現(xiàn)提高IgG Fc的唾液酸含量能夠降低ADCC的活性，使其與細(xì)胞表面抗原結(jié)合活性降低。此外，人類IgG中還存在少量無巖藻糖Fc糖鏈(含或不含二等分乙酰葡糖胺)和少量高甘露糖結(jié)構(gòu)。Anthony等[47]發(fā)現(xiàn)含有末端乙酰葡糖胺基化的IgG可與血清甘露糖結(jié)合蛋白結(jié)合并激活補(bǔ)體。Zhou等[48]用甘露糖抑制劑(kifunensine)處理CHO細(xì)胞，干預(yù)某血管瘤單抗糖鏈的合成，發(fā)現(xiàn)高甘露醇處理可提高單抗的療效。

2.3 Fc受體改造

研究者發(fā)現(xiàn)Fc受體與多種抗體依賴性疾病相關(guān)，是治療性抗體藥物在治療過程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，單抗的Fc段能夠通過介導(dǎo)其效應(yīng)功能提升其功效[49-50]。目前，市售治療性單抗多為IgG1亞型，其Fc段效應(yīng)功能較高，然而，有著功能多樣性的IgG1同型和IgG亞型通過增加穩(wěn)定性，如將兩種抗體同型的氨基酸序列進(jìn)行交換(cross-isotypes)，以提高臨床安全性，減少不良事件的發(fā)生[43, 51]。

在IgG亞型中，雖然IgG4含量最少，但I(xiàn)gG4型抗體最具生物學(xué)獨(dú)特性[52]，其鉸鏈區(qū)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)決定其缺乏激活補(bǔ)體[53]和結(jié)合Fc受體的能力[54]，在不需要Fc段效應(yīng)功能的治療性抗體開發(fā)方面是主要選擇，如自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[55]。故用非巖藻糖基化IgG4同型抗體替代IgG1亞型單抗，能夠增加單抗的臨床療效[43]。但Bruhns等[54]發(fā)現(xiàn)，IgG4抗-CD28抗體用于臨床試驗(yàn)時(shí)，在志愿者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)IgG4復(fù)合物與FcγRIIA及FcγRIIIA結(jié)合的沉積物，可引起多器官功能障礙。這意味著，治療性抗體也存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)，需要針對性的修飾或改造，以降低或避免這種風(fēng)險(xiǎn)。