自噬與姜黃素抗腫瘤作用的關(guān)系

徐繼明，丁浩然，李質(zhì)馨，王弘珺

吉林醫(yī)藥學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，吉林 132013

姜黃素是從姜黃根莖中提取到的酸性多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂、清除自由基、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[1]。尤為重要的是，美國國立衛(wèi)生研究院已經(jīng)批準(zhǔn)在腺瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等多種癌癥的臨床試驗(yàn)中應(yīng)用姜黃素。其抑制腫瘤機(jī)制包括，調(diào)控癌基因、抑癌基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯或細(xì)胞凋亡；抑制血管內(nèi)皮生長因子減少腫瘤新生營養(yǎng)血管生成[2]。近年研究顯示，姜黃素可以誘導(dǎo)肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、膠質(zhì)瘤、白血病等多種腫瘤細(xì)胞自噬[3]。鑒于細(xì)胞自噬在腫瘤細(xì)胞生存與凋亡中起雙向作用，本文主要綜述細(xì)胞自噬的研究進(jìn)展，姜黃素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的途徑及其與腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為姜黃素調(diào)控細(xì)胞自噬及治療腫瘤提供理論基礎(chǔ)。

細(xì)胞自噬的分類、過程與機(jī)制

細(xì)胞自噬是細(xì)胞為了應(yīng)對缺氧、代謝應(yīng)激和ATP消耗，將細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、大分子物質(zhì)和過量或損傷的細(xì)胞器靶向運(yùn)輸?shù)饺苊阁w降解的過程[4- 5]。細(xì)胞自噬受自噬相關(guān)基因調(diào)控，這些基因高度保守，在哺乳動(dòng)物間有同源體。在一定程度上細(xì)胞自噬維持了蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的更新及清除平衡，避免細(xì)胞凋亡發(fā)生，但是過度自噬可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)可見大量自噬體和自噬性溶酶體，這是自噬性死亡區(qū)別于細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞壞死的主要特征。

細(xì)胞自噬分類根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體的途徑，將細(xì)胞自噬分為3種類型：微自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬和巨自噬[6]。微自噬是溶酶體膜內(nèi)陷，直接將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)吞入并降解的過程。分子伴侶介導(dǎo)的自噬是可溶性蛋白質(zhì)被分子伴侶識(shí)別，與溶酶體膜蛋白結(jié)合，穿過溶酶體膜，進(jìn)入溶酶體后再被降解的過程[7]。通常所指的細(xì)胞自噬為巨自噬，細(xì)胞質(zhì)中的物質(zhì)被雙層膜包裹形成自噬體，再轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體降解的過程。

細(xì)胞自噬過程細(xì)胞自噬過程主要分為以下階段，首先，細(xì)胞啟動(dòng)自噬反應(yīng)，胞漿中出現(xiàn)大量的游離膜性結(jié)構(gòu)，稱為前自噬泡，這些雙層膜來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或者線粒體[8- 10]。隨著膜的逐漸延伸，需要降解的物質(zhì)被膜結(jié)構(gòu)完全包繞形成自噬體，然后自噬體與溶酶體靶向融合形成自噬性溶酶體。自噬體外膜與溶酶體膜融合，自噬體內(nèi)膜及其包裹的物質(zhì)進(jìn)入溶酶體，被溶酶體酶降解，降解產(chǎn)物返回胞漿循環(huán)使用。

細(xì)胞自噬機(jī)制細(xì)胞自噬受多種信號(hào)途徑調(diào)控，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)(Akt)-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)是調(diào)控自噬的主要信號(hào)[11- 13]。mTORC1通過直接磷酸化自噬相關(guān)基因13(autophagy-related gene 13，ATG13)和Unc- 51樣自噬激活激酶1(Unc- 51-like autophagy activating kinase 1，ULK1)，抑制細(xì)胞自噬。細(xì)胞內(nèi)ATP減少或AMP/ATP增加時(shí)，腺苷酸激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通過磷酸化mTOR調(diào)控相關(guān)蛋白R(shí)aptor 抑制mTORC1活性、解除mTORC1對細(xì)胞自噬的抑制作用。尤為重要的是AMPK激活ULK1，ULK1激活并磷酸化ATG13，形成ULK1-ATG13-黏著斑激酶家族相互作用2蛋白(FIP200)-ATG101復(fù)合體，活化的ULK1復(fù)合體從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或其他位置，開始形成自噬膜。然后ULK1激活PI3K Ⅲ復(fù)合體(由Vps34、Beclin- 1、Vps15、ATG14等組成)活化細(xì)胞自噬反應(yīng)。PI3K Ⅲ復(fù)合體通過結(jié)合紫外線抵抗相關(guān)基因和自噬/芐氯素1調(diào)節(jié)因子1催化Vps34活性?；罨腣ps34促進(jìn)磷脂酰肌醇3磷酸[PtdIns(3)P]形成，PI3P招募 WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域磷酸肌醇交互蛋白2[14]促進(jìn)早期自噬體形成，并與囊泡形態(tài)有關(guān)。在啟動(dòng)細(xì)胞自噬時(shí)，ULK1至關(guān)重要。

自噬泡的延伸和成熟依賴泛素樣自噬體蛋白系統(tǒng)、ATG12系統(tǒng)和ATG8系統(tǒng)(與哺乳動(dòng)物L(fēng)C3同源)。由WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域磷酸肌醇交互蛋白2招募ATG16L1與ATG5和ATG12形成ATG12-ATG5-ATG16L1超分子蛋白復(fù)合體(即ATG12系統(tǒng))，決定自噬泡的形成位置[15]。然后，ATG12系統(tǒng)充當(dāng)E3泛素酶將磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)連接到ATG8系統(tǒng)。先由蛋白水解酶ATG4切割LC3為LC3-I，在ATG7和ATG3作用下LC3-I和PE連接成LC3-Ⅱ(ATG8/PE復(fù)合體)[16]。LC3-Ⅱ促進(jìn)自噬體的擴(kuò)展以及成熟，它是自噬體的標(biāo)志蛋白，吸附于自噬體膜[17]。自噬體的最終形成受ATG2A和ATG2B調(diào)節(jié)，具體過程并不清楚。

姜黃素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的機(jī)制

借助熒光顯微鏡和電子顯微鏡，有研究顯示姜黃素處理的肺腺癌A549細(xì)胞出現(xiàn)自噬體與自噬性溶酶體，3-MA抑制自噬作用后A549細(xì)胞存活率增加[18]，表明姜黃素調(diào)控自噬反應(yīng)與腫瘤生存相關(guān)?，F(xiàn)有研究表明，姜黃素能誘導(dǎo)口腔癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺腺癌、子宮平滑肌肉瘤等多種腫瘤發(fā)生自噬，受姜黃素調(diào)控的自噬信號(hào)如下。

姜黃素通過AMPK-mTOR信號(hào)調(diào)控細(xì)胞自噬姜黃素誘導(dǎo)人黑色素瘤A375和C8161細(xì)胞以及胃癌SGC- 7901和BGC- 823細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，降低了磷酸化AKT、mTOR及S6K1表達(dá)，表明姜黃素抑制PI3K-AKT-mTORC1信號(hào)途徑，促進(jìn)細(xì)胞自噬[19- 20]。另有研究顯示,在乳腺癌MDA-MB- 231細(xì)胞中使用姜黃素后，增加AKT泛素化并促進(jìn)AKT聚集，結(jié)果AKT表達(dá)降低；應(yīng)用自噬抑制劑CQ、shRNA敲除ATG5或ATG7阻斷自噬后，AKT表達(dá)增加[21]。表明姜黃素促進(jìn)AKT聚集并通過自噬途徑降解AKT，因此激活了mTORC1信號(hào)，從而促進(jìn)細(xì)胞自噬。進(jìn)一步研究顯示姜黃素增加結(jié)腸癌SW480和SW620細(xì)胞的磷酸化AMPKα表達(dá)，導(dǎo)致mTORC1下游信號(hào)S6K1及其底物S6的磷酸化降低，表明姜黃素具有調(diào)控AMPK-mTORC1信號(hào)通路的作用[22]。在應(yīng)用AMPK特異性抑制劑阻斷AMPK信號(hào)或者小干擾RNA敲除AMPKα1后，由姜黃素誘導(dǎo)的A549細(xì)胞自噬受到抑制[23]。綜上，姜黃素通過激活A(yù)MPK活化TSC1/2，進(jìn)而抑制mTORC1信號(hào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬發(fā)揮其抗腫瘤作用。目前尚不清楚，姜黃素調(diào)控AMPK激活腫瘤細(xì)胞自噬的機(jī)制，以及姜黃素對線粒體AMP、ATP代謝的影響等，相關(guān)研究仍需深入。

姜黃素調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EB激活細(xì)胞自噬轉(zhuǎn)錄因子EB(transcriptional factor EB，TFEB)是mTOR下游的直接作用靶點(diǎn)，是調(diào)控細(xì)胞自噬和溶酶體發(fā)生的主要分子。通常mTORC1磷酸化TFEB，使其定位于胞漿,其活性受到抑制[24]。當(dāng)細(xì)胞饑餓或藥物抑制mTORC1時(shí)，TFEB轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，激活溶酶體功能，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[25]。在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中，姜黃素抑制AKT-mTORC1通路，降低了磷酸化AKT和S6K1，促進(jìn)細(xì)胞自噬[26]。原因是姜黃素增加TFEB表達(dá)并且結(jié)合于TFEB，促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位，增加了下游靶分子溶酶體膜蛋白1、紫外線抵抗相關(guān)基因和ATG9B的表達(dá)，進(jìn)而激活自噬和增加溶酶體功能。另有研究顯示姜黃素類似物C1也具有結(jié)合TFEB促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位、激活TFEB的作用[27]?？傊?，姜黃素一方面調(diào)控AMPK-mTORC1信號(hào)激活細(xì)胞自噬，另一方面激活TFEB，增加溶酶體功能促進(jìn)細(xì)胞自噬。

姜黃素通過Beclin-1/Bcl-2調(diào)控細(xì)胞自噬Beclin- 1/Bcl- 2是調(diào)控細(xì)胞自噬與凋亡的重要分子，Beclin- 1參與PI3K Ⅲ復(fù)合物，對自噬泡的形成至關(guān)重要；Bcl- 2具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，并且Bcl- 2結(jié)合Beclin- 1阻止PI3K Ⅲ復(fù)合物形成、抑制細(xì)胞自噬反應(yīng)[28]。當(dāng)細(xì)胞營養(yǎng)充足時(shí)，Bcl- 2結(jié)合Beclin- 1和Bax/Bak，細(xì)胞自噬與凋亡均被抑制。當(dāng)細(xì)胞饑餓時(shí)，c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK1)活化并磷酸化Bcl- 2，Beclin- 1/Bcl- 2復(fù)合物解體，Beclin- 1促進(jìn)細(xì)胞自噬；而磷酸化Bcl- 2結(jié)合Bax，保證線粒體膜完整，避免細(xì)胞色素C釋放，細(xì)胞凋亡被抑制。當(dāng)細(xì)胞極度饑餓時(shí)，JNK1使Bcl- 2高度磷酸化，Bcl- 2與Bax分離，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3被激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29]。研究顯示姜黃素能降低Bcl- 2表達(dá)、增加Beclin- 1和LC3-Ⅱ表達(dá)，同時(shí)激活細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬[20]。應(yīng)用芐氧羰基纈氨酸-丙氨酸-天冬氨酸氟甲基酮抑制細(xì)胞凋亡、Baf-A1抑制自噬后，白血病K562細(xì)胞死亡降低，表明自噬與凋亡是姜黃素誘導(dǎo)K562細(xì)胞死亡的機(jī)制[30]，表明調(diào)控自噬反應(yīng)是姜黃素的抗腫瘤機(jī)制。

姜黃素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑調(diào)控細(xì)胞自噬腫瘤細(xì)胞經(jīng)常面臨缺氧、營養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激以及高代謝等情況，由此引起的蛋白合成和折疊紊亂激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。細(xì)胞通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核信號(hào)1、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶及活化轉(zhuǎn)錄因子6增加蛋白質(zhì)折疊、抑制蛋白質(zhì)合成或者加速蛋白質(zhì)降解，重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，維持其功能。如果不能維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，腫瘤細(xì)胞將發(fā)生凋亡。姜黃素作用于肝細(xì)胞癌Huh- 7細(xì)胞時(shí)，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，線粒體攝取Ca2+引起細(xì)胞色素c釋放，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。但是低濃度姜黃素或者作用早期，姜黃素可以激活自噬反應(yīng)清除損傷線粒體，避免細(xì)胞凋亡[31]。表明姜黃素通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控線粒體Ca2+信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞自噬與凋亡的調(diào)控。

總之，姜黃素通過調(diào)控AMPK-mTOR、Beclin- 1/Bcl- 2、TFEB、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、活性氧以及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2等信號(hào)[2，32- 34]調(diào)控自噬反應(yīng)，在不同腫瘤細(xì)胞中，其調(diào)控細(xì)胞自噬機(jī)制不完全相同。

姜黃素誘導(dǎo)自噬對細(xì)胞凋亡的影響

不同腫瘤細(xì)胞對姜黃素的反應(yīng)性不盡相同，既存在姜黃素活化自噬增加細(xì)胞凋亡的證據(jù)，也存在姜黃素活化自噬促進(jìn)細(xì)胞生存的證據(jù)。例如，單獨(dú)使用自噬阻斷劑，并未明顯抑制胃癌細(xì)胞生存，但是聯(lián)合使用自噬阻斷劑與姜黃素時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著增加[20，35]。另外，JNK途徑是調(diào)控細(xì)胞自噬與凋亡的重要信號(hào)，在骨肉瘤MG63細(xì)胞中，姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且上調(diào)p-JNK和ATG5促進(jìn)細(xì)胞自噬。聯(lián)合使用姜黃素和自噬抑制劑3-MA后，3-MA阻止磷酸化JNK和ATG5的上調(diào)、抑制細(xì)胞自噬，促進(jìn)了MG63細(xì)胞凋亡[36]。上述研究表明，活化自噬反應(yīng)是一種細(xì)胞保護(hù)性機(jī)制，阻斷自噬增加了姜黃素的促凋亡作用。由于細(xì)胞自噬與凋亡受多種相同信號(hào)途徑調(diào)控，因此二者之間存在交互作用。例如，Bcl- 2是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，Beclin- 1對于激活細(xì)胞自噬至關(guān)重要，一方面姜黃素降低Bcl- 2表達(dá)、解除了Bcl- 2對Beclin- 1的抑制，另一方面姜黃素增加Beclin- 1表達(dá)，因此姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)激活了細(xì)胞自噬。然而轉(zhuǎn)移性乳腺癌MCF- 7細(xì)胞過表達(dá)Bcl- 2，則Bcl- 2結(jié)合Beclin- 1抑制自噬反應(yīng)，因此腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)姜黃素抵抗[37]。如果應(yīng)用抑制劑阻斷PI3K-AKT信號(hào)通路，就能增加姜黃素的促凋亡作用，克服Bcl- 2過表達(dá)對細(xì)胞自噬的抑制作用，促進(jìn)MCF- 7細(xì)胞凋亡。綜上，作為多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物，姜黃素具有調(diào)控細(xì)胞自噬和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。對于多數(shù)腫瘤細(xì)胞，低濃度姜黃素激活細(xì)胞自噬促進(jìn)腫瘤生存；持續(xù)作用后，姜黃素誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)或者轉(zhuǎn)變?yōu)樽允尚运劳龌蛘叽龠M(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

小結(jié)與展望

細(xì)胞自噬在多種疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，姜黃素的抗腫瘤機(jī)制及其臨床應(yīng)用是中藥抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。大量研究表明，在腫瘤形成前細(xì)胞自噬減少毒性物質(zhì)蓄積、穩(wěn)定基因組，從而抑制癌變，一旦腫瘤形成，細(xì)胞自噬將為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)。鑒于細(xì)胞自噬在腫瘤發(fā)生中的雙重作用以及細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡的交互作用，因此深入探究姜黃素調(diào)控細(xì)胞自噬對腫瘤的影響非常必要，相關(guān)研究將為腫瘤治療提供新思路。此外，姜黃素也被用于治療心肌缺血、阿爾茨海默病以及衰老等，在這些研究中，姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬減輕了心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的病理損傷?？傊?，姜黃素具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，其作用機(jī)制尚需深入研究。