李登亮， 伊淑帥， 郭衍冰，2， 劉宏凱， 牛江婷， 董國英， 胡桂學(xué)

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林 長春 130118 ；2. 吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院， 吉林 長春 130022；3. 北京師范大學(xué)全球變化與地球系統(tǒng)科學(xué)研究院， 北京 海淀 100875)

免疫球蛋白(IgG)是血液中除白蛋白外最豐富的蛋白，由通過二硫鍵連接的兩條輕鏈和兩條重鏈組成，呈“Y”型。 免疫球蛋白(IgG)約占血液總免疫球蛋白的75%，并且是與體液免疫應(yīng)答相關(guān)的主要免疫球蛋白[1]，作為參與機(jī)體對(duì)抗感染的主要分子，具有與病原體或毒素結(jié)合，激活補(bǔ)體，加強(qiáng)吞噬作用的殺傷作用，啟動(dòng)過敏反應(yīng)和減輕移植器官排斥的能力，是臨床應(yīng)用中使用最廣泛的免疫球蛋白[2-3]。 IgG 與其他免疫球蛋白相比，具有持續(xù)時(shí)間長、含量高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，一般情況下，通過對(duì)動(dòng)物機(jī)體或動(dòng)物性產(chǎn)品內(nèi)特異性IgG 含量的測(cè)定，可判斷該動(dòng)物是否曾患有相關(guān)疾病或其產(chǎn)品是否合格，這在動(dòng)物的出入境檢驗(yàn)檢疫及其產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用十分廣泛，因此IgG 的分離純化倍受關(guān)注。本文對(duì)不同的血清IgG 提純工藝進(jìn)行了詳細(xì)的闡述與比較，以期為IgG 生產(chǎn)工藝的改良提供理論參考。

1 免疫球蛋白的粗提

1.1 有機(jī)溶劑沉淀法 目前，有機(jī)溶劑沉淀法是一種被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)制劑生產(chǎn)的提純方法，其中，低溫乙醇沉淀法是生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的一種方法，也是WHO 規(guī)程和中國生物制品規(guī)程推薦用的方法。該方法是1949 年由美國科學(xué)家Cohn 等首次提出，用于制備血清IgG，其作用原理是利用有機(jī)溶劑改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)，從而通過控制蛋白質(zhì)之間靜電相互作用的辦法選擇性地沉淀蛋白。 低溫乙醇沉淀法可同時(shí)分離多種血漿成分，具有良好的分辨率和純化效果，而且對(duì)細(xì)菌和病毒有消除滅活的作用。 但該方法存在的不足也不容忽視，如40% ～50%的IgG 可能在非IgG 上清液中丟失或與雜質(zhì)共沉淀。 此外，沉淀階段需要在低于0 ℃的溫度下進(jìn)行，以避免蛋白質(zhì)的變性[4]。 高濃度的乙醇也會(huì)影響IgG 的穩(wěn)定[5]。

1.2 鹽析法 鹽析法的原理是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在同一濃度的鹽溶液中溶解度不同及同一蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中溶解度也不同，從而通過改變鹽溶液濃度達(dá)到目的蛋白(如IgG)與其他雜質(zhì)蛋白分離純化的目的。 常用的鹽析法有飽和硫酸銨分步沉淀法、多聚磷酸鈉絮凝法、FeCl3沉淀法等。

1.2.1 飽和硫酸銨分步沉淀法 飽和硫酸銨分步沉淀法在人以及哺乳動(dòng)物血清蛋白的分離純化中得到了廣泛的應(yīng)用。 由于水中的硫酸銨溶解度大且受溫度影響小，一般不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性；此外，高濃度硫酸銨對(duì)微生物和蛋白酶具有抑制作用，從而保護(hù)蛋白質(zhì)生物活性。 Mariam S H S 等通過飽和硫酸銨沉淀法成功地純化針對(duì)乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的IgG，回收率和純度分別為99%和94%[8]。 IgG 的提取過程中，如果結(jié)合蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)沉淀就更有利于除去雜蛋白。 如在提純豬血清IgG 時(shí)，37%硫酸銨飽和度下，pH 值4.5時(shí)IgG 回收率為70%，而pH 值7.4 時(shí)IgG 回收率達(dá)到80.5%[6]。 該方法操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品含量和得率都較高，利于工業(yè)化大量生產(chǎn)。 缺點(diǎn)是沉淀的抗體必須再溶解并存在蛋白質(zhì)聚集體，且鹽析過程所花費(fèi)的時(shí)間較長[9]。

1.2.2 多聚磷酸鹽或FeCl3沉淀法 相對(duì)于硫酸銨沉淀法，多聚磷酸鹽沉淀法或FeCl3沉淀法提純IgG 更安全可靠，尤其是當(dāng)IgG 作為醫(yī)藥行業(yè)和保健食品行業(yè)的重要添加劑。 多聚磷酸鹽作為食品添加劑可以在肉制品中使用以提高產(chǎn)品的保水性，或者作為絮凝劑用于食品加工。 而FeCl3沉淀法從原料中提取的IgG 溶液中只含有Fe3+離子，只調(diào)節(jié)pH 值至弱堿性，F(xiàn)e3+離子就會(huì)和水中的OH-離子結(jié)合成Fe(OH)3沉淀，方便快捷的達(dá)到了除鹽的效果，即使殘存少量的Fe3+離子也對(duì)人體有益處。 羅磊采用多聚磷酸鹽沉淀法及FeCl3沉淀法成功從豬血清中提純IgG，并表明FeCl3分離豬血清IgG 操作簡(jiǎn)便，分離效果好，安全可靠，實(shí)用性高，可以用于食品用IgG 的工業(yè)化生產(chǎn)[6]。 龐晨通過這兩種方法成功從牦牛血清中分離純化IgG，得率分別為6.48 mg/mL 和8.28 mg/mL[7]。

1.3 正辛酸-硫酸銨法 正辛酸-硫酸銨法是將有機(jī)溶劑辛酸與無機(jī)鹽硫酸銨相結(jié)合的一種提純免疫球蛋白的方法。 其提純IgG 的原理是pH 值為4.2 ～4.8 條件下辛酸可沉淀血清中的非免疫球蛋白類蛋白，含免疫球蛋白的上清液再用飽和硫酸銨沉淀法，從而對(duì)血清中的IgG 進(jìn)行分離純化。 有試驗(yàn)表明，一定濃度的辛酸主要使血清中的白蛋白沉淀，而不會(huì)影響免疫球蛋白的分級(jí)純化[10，11]，并且在免疫球蛋白沉淀過程中，辛酸還可避免免疫球蛋白的降解或聚集[12，13]。 該方法允許球蛋白濃度≥15 ng/mL，比較適合于大量、高效價(jià)血清IgG 提純，且簡(jiǎn)單易行，無需復(fù)雜的設(shè)備儀器。 缺點(diǎn)是IgG 需要溶解，在商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中，操作步驟增加會(huì)使分餾過程易受微生物污染。

2 免疫球蛋白的進(jìn)一步純化

免疫球蛋白經(jīng)粗分級(jí)后，為了得到更高純度的IgG，通常要進(jìn)行細(xì)分級(jí)，這一過程常采用柱層析的方法。 常見的有凝膠過濾層析法、離子交換層析法、親和層析法等，細(xì)分級(jí)后IgG 的純度一般可達(dá)到90%以上。

2.1 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析法是一種呈溫和的物理性純化方法，一般不影響蛋白質(zhì)分子的生物活性，該法是基于樣品中蛋白質(zhì)分子的相對(duì)大小和立體結(jié)構(gòu)差異，在通過多孔凝膠介質(zhì)時(shí)達(dá)到分離純化目的[15]。 對(duì)于Ig 類抗體，凝膠過濾層析可去除與目的抗體具有相同電荷性的雜質(zhì)[14]。 當(dāng)然，相對(duì)于親和層析法分離純化目的蛋白，凝膠過濾層析的特異性相對(duì)較差，且因靶蛋白在柱中不能被保留而呈現(xiàn)相對(duì)較低的分辨率，但該方法仍是與其他類型純化組合使用的有價(jià)值的方法。

2.2 離子交換層析 離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)分子所帶電荷及電荷密度不同，通過不同蛋白質(zhì)吸附到吸附劑上的能力差異來實(shí)現(xiàn)分離純化免疫球蛋白。 蛋白質(zhì)是由氨基酸構(gòu)成的兩性電解質(zhì)，其所帶電荷由溶液pH 值所決定，且在低離子強(qiáng)度時(shí)可被同性的離子競(jìng)爭(zhēng)置換而解脫，通過增強(qiáng)洗脫液的離子強(qiáng)度或改變pH 值來改變蛋白質(zhì)的結(jié)合能力，使不同電荷的蛋白質(zhì)得以分離。 Wongchuphan 等成功從兔血清中提純IgG，產(chǎn)率為80%，純度達(dá)到83%[16]。 該法提純IgG 也存在一些不足，如用時(shí)長，裝柱要求高，期間也會(huì)由于各種因素影響而使蛋白質(zhì)變性，易變性失活的抗體不宜采用此方法。

2.3 親和層析 親和層析是一種特異性吸附層析技術(shù)，其原理是以目標(biāo)分子與親和配體特異性、可逆性結(jié)合為基礎(chǔ)，通過生物高分子所特有的生物活性而進(jìn)行的蛋白質(zhì)分離、提純和濃縮。 親和層析具有高效、快速、純化結(jié)果好等優(yōu)點(diǎn)，并逐漸成為大分子生物提純技術(shù)之一。 但存在偶聯(lián)配體純度要求高；目的蛋白活性可能被洗脫液損害，成本高，費(fèi)用大等弊端。 因此，許多研究者試圖構(gòu)建純化配體作為蛋白A 的替代[17-18]。 Tomoya Sugita 等[19]使用肽陣列篩選結(jié)合IgG 的Fc 區(qū)的肽配體，獲得可識(shí)別結(jié)合人和小鼠IgG 的高親和力八聚體肽NKFRGKYK和NARKFYKG，抗體獲得的產(chǎn)量分別為69% 和80%，從而表明篩選的肽可用作IgG 的親和純化配體。 可見，親和層析過程親和配體的選擇逐漸成為IgG 純化的熱點(diǎn)問題。

3 展望

免疫球蛋白具有很多重要的生理功能，尤其是IgG，其不僅在血液免疫球蛋白中含量豐富，而且在臨床診療、生物制藥、疫苗生產(chǎn)、疾病預(yù)防及食品添加等領(lǐng)域已經(jīng)廣泛被應(yīng)用。 隨著近年來免疫學(xué)和遺傳工程的發(fā)展，對(duì)具有高純度，強(qiáng)生物活性和低成本的抗體的需求變得越來越迫切。 因此，IgG 的制備已經(jīng)成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一，許多新型方法應(yīng)運(yùn)而生。 雙水相系統(tǒng)就是利用蛋白質(zhì)分子可以被特定相穩(wěn)定萃取，從而增加目標(biāo)蛋白質(zhì)(IgG)濃度，達(dá)到更有效地萃取效果[20]。 天然IgG 結(jié)合蛋白如蛋白A 和來自細(xì)菌來源的蛋白G 已被普遍用作配體。 然而由于該配體的生產(chǎn)成本高，穩(wěn)定性差，存在宿主細(xì)胞成分的污染，以及需要開發(fā)柱結(jié)合抗體的溫和洗脫條件等，所以為了補(bǔ)充天然蛋白質(zhì)配體，一些由天然或非天然氨基酸組成的肽合成配體得到了廣泛的探索并已經(jīng)被成功開發(fā)[21-22]。 然而當(dāng)前應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的抗體分離純化工藝比較傳統(tǒng)，這就需要尋求一種將傳統(tǒng)生產(chǎn)與新型工藝相結(jié)合的得率高、對(duì)抗體活性無影響、節(jié)約成本、可加工集成的方法來代替?zhèn)鹘y(tǒng)工藝。 隨著IgG 提取純化技術(shù)的更新發(fā)展，免疫球蛋白提純必將實(shí)現(xiàn)工業(yè)化量產(chǎn)，其應(yīng)用范圍也會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大，因此對(duì)IgG 的開發(fā)應(yīng)用前景相當(dāng)樂觀。