張 蕾， 郭曦堯， 馬世宏， 程 義， 王建軍， 楚沖之， 李月紅

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 教育部動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118 ；2.內(nèi)蒙古烏蘭察布市獸醫(yī)監(jiān)察所， 內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000)

中國(guó)的西北、東北及華北等內(nèi)陸地區(qū)有較多的高鹽堿化湖泊、泡沼等水域，此類水域的水質(zhì)具有高鹽堿、高pH 值、離子系數(shù)高、離子比例失調(diào)等特點(diǎn)[1-2]。 水域鹽堿濃度的變化與魚類的生存及生長(zhǎng)息息相關(guān)，普通淡水類魚蝦難以適應(yīng)高鹽堿水域環(huán)境，過高的鹽堿濃度會(huì)對(duì)其機(jī)體造成不可逆的損傷。 鹽堿度的變化可直接影響魚類機(jī)體血液、血清各項(xiàng)生理生化指標(biāo)變化或產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過研究血液血清生理生化指標(biāo)及抗氧化酶活性的變化對(duì)病理、生理學(xué)、毒理學(xué)或動(dòng)物的臨床診斷均有較大的意義。 近年來，鹽堿水域養(yǎng)殖技術(shù)也已取得較大發(fā)展[3]，但有關(guān)鹽堿度變化對(duì)水生生物機(jī)體脅迫所造成的損傷研究報(bào)道還較少。 因此，本文通過設(shè)置不同濃度梯度的鹽堿聯(lián)合脅迫試驗(yàn)，從而了解其對(duì)異育銀鯽的慢性損傷效應(yīng)，以期為進(jìn)一步的研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑 碳酸氫鈉(NaHCO3)、氯化鈉(NaCl)，購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；試劑為分析純(AR 級(jí))，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。

1.2 鹽堿脅迫試驗(yàn) 試驗(yàn)異育銀鯽120 尾，由長(zhǎng)春市新立城水庫(kù)提供。 飼養(yǎng)用水為充分曝氣的自來水，水溫維持在(25 ±2)℃，pH 值為7.3 ～7.5，氨氮含量為0.4 ～0.5 mg/L，保持供養(yǎng)泵24 h 開啟，每缸水為60 L。 在2 周的馴化飼養(yǎng)后，隨機(jī)選取健康、個(gè)體大小均勻的鯽魚進(jìn)行分組試驗(yàn)，為空白對(duì)照Ⅰ組和鹽堿脅迫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，設(shè)置NaCl 濃度梯度為1 mmol/L-1、2 mmol/L-1、3 mmol/L-1(分別稱取3.51 g、7.01 g、10.52 g NaCl 溶于裝有60 L 水的水族缸中)；NaHCO3濃度梯度為15 mmol/L-1、30 mmol/L-1、45 mmol/ L-1(分 別 稱 取75.6 g、151.2 g、226.8 g NaHCO3溶于裝有60 L 水的水族缸中)每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 尾魚。 試驗(yàn)期間鹽堿脅迫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組水體pH 值分別為8.8±0.2、9.5 ±0.3、10.4 ±0.2；氨氮含量分別為0.7±0.1 mg/L、0.9±0.2 mg/L、1.2 ±0.1 mg/L。 試驗(yàn)為期6 周，期間每3 天定時(shí)換水，空白對(duì)照組換水量約為50%，鹽堿脅迫組換水量約為70%。

1.3 樣品處理 尾椎靜脈取血方式采取各組鯽魚血液，分裝于無菌抗凝管及促凝管中，4 ℃暫時(shí)保存。 組織采集即在冰盤上剖檢，收集組織，無菌生理鹽水清洗后用濾紙吸干置于無菌EP 管中-80 ℃保存。

1.4 血液及血清生理生化指標(biāo)測(cè)定 使用BayerDVIA 120 型血細(xì)胞分析儀進(jìn)行指標(biāo)的測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)包括白細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞平均體積、血紅蛋白、平均血紅蛋白濃度、血小板。 使用貝克曼(ProCX4)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)、血糖(GLU)、堿性磷酸酶(AKP)、乳酸脫氫酶(LDH)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)。

1.5 組織中抗氧化酶的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量后按質(zhì)量(g)∶體積(mL) =1∶9的比例加入9 倍體積的生理鹽水，剪碎組織并在冰水浴條件下制備勻漿，2 500 ～3 000 r/min 離心10 min，吸取上清待用。SOD 及CAT 活性測(cè)定的具體操作均按南京建成生物工程有限公司試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析 存活率=存活尾數(shù)/總尾數(shù)×100；增重率=(Mt-Mo)/Mo ×100；Mt 為試驗(yàn)?zāi)~體質(zhì)量，Mo 為試驗(yàn)初魚體質(zhì)量；試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用IBM SPSS Statistics 20軟件Tukey 單因素分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 異育銀鯽存活率及增重率 表1 為各組異育銀鯽存活率及增重率結(jié)果。 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組增重率均顯著低于Ⅰ組，其中Ⅳ組為負(fù)增重率。 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組存活率均為100%，Ⅳ組存活率為70%。

表1 異育銀鯽存活率及增重率

2.2 異育銀鯽血液生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 下表2 為異育銀鯽血液各生理指標(biāo)的測(cè)定值。 相比于Ⅰ組，Ⅱ組白細(xì)胞及血小板數(shù)均顯著提高(P ＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ組白細(xì)胞數(shù)顯著降低(P ＜0.05)，Ⅲ組血小板數(shù)降低不顯著(P ＞0.05)，Ⅳ組血小板數(shù)顯著降低(P ＜0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組紅細(xì)胞平均體積均顯著降低(P ＜0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組血紅蛋白顯著提高(P ＜0.05)，Ⅱ、Ⅳ組紅細(xì)胞數(shù)顯著提高(P ＜0.05)，Ⅲ組紅細(xì)胞數(shù)提高不顯著(P ＞0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組紅細(xì)胞壓積、平均血紅蛋白濃度均顯著提高(P ＜0.05)。

表2 異育銀鯽血液生理指標(biāo)測(cè)定值

2.3 異育銀鯽血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 表3 為異育銀鯽血清各生理指標(biāo)的測(cè)定值。 相比于Ⅰ組，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組ALT、AST 活性均顯著提高(P ＜0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組UREA、GLU、AKP、LDH、TP、ALB 水平均有不同程度提高，其中Ⅱ組UREA、GLU 水平差異不顯著(P ＞0.05)；相比于Ⅰ組，Ⅱ組CREA 水平顯著降低(P ＜0.05)，Ⅲ組CREA 水平降低不顯著(P ＞0.05)，Ⅳ組CREA 水平顯著提高(P ＜0.05)。

表3 異育銀鯽血清生化指標(biāo)測(cè)定值

2.4 異育銀鯽肝胰臟SOD 及CAT 活性測(cè)定結(jié)果 各處理組異育銀鯽肝胰臟SOD 及CAT 活性變化如下圖1 所示，與對(duì)照組相比，Ⅱ組SOD及CAT 活性均顯著升高(P ＜0. 05)，Ⅲ、Ⅳ組SOD 及CAT 活性均顯著降低(P ＜0. 05)。

圖1 肝胰臟SOD(左)及CAT(右)活性

3 討論

3.1 對(duì)血液生理指標(biāo)的影響 水體鹽度可影響魚類滲透調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致機(jī)體組織失水、代謝下降。堿度對(duì)魚類的損傷效應(yīng)屬于綜合致毒效應(yīng)，堿濃度的變化主要導(dǎo)致魚類產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性[4]。 通過測(cè)定血液生理指標(biāo)的變化來評(píng)估魚類機(jī)體的新陳代謝能力和生理健康水平已被廣泛應(yīng)用[5]。 本試驗(yàn)中，鹽堿脅迫組異育銀鯽紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞壓積、血紅蛋白濃度及平均血紅蛋白濃度均高于對(duì)照組，這可能是由于鹽堿脅迫，機(jī)體做出的適應(yīng)性反應(yīng)從而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。 張玉等[6]研究發(fā)現(xiàn)，鹽堿水域魚類機(jī)體與滲透壓調(diào)節(jié)有關(guān)的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積等指標(biāo)均顯著高于淡水水域中的魚類，與本試驗(yàn)結(jié)果相仿。 而白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)隨著水體鹽堿濃度的升高表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，表明高濃度的鹽堿水環(huán)境對(duì)異育銀鯽機(jī)體造成一定程度的損傷。

3.2 對(duì)血清生化指標(biāo)的影響 血清生化指標(biāo)的變化可從側(cè)面反映魚類機(jī)體新陳代謝的狀況[7]。CREA 水平用于診斷腎功能狀況，其水平的增高多見于各種原因而引起的腎小球?yàn)V過功能的減退。最高濃度鹽堿脅迫組的CREA 水平顯著升高表明異育銀鯽腎功能受損。 與對(duì)照組相比，鹽堿脅迫組血清GLU 水平均顯著升高，其中Ⅲ、Ⅳ組與對(duì)照組差異性顯著，表明異育銀鯽組織細(xì)胞的代謝能力下降。 蛋白質(zhì)作為血清中重要的組成成分，在魚類生理和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，血清TP、ALB 主要參與維持機(jī)體內(nèi)血漿膠體滲透壓的穩(wěn)定性，其中TP 還可維持血管內(nèi)酸堿度的平衡[8]。 本試驗(yàn)中，鹽堿脅迫組血清TP、ALB 水平均顯著高于對(duì)照組，表明水體鹽堿濃度的升高改變了機(jī)體滲透壓，刺激機(jī)體提高ALB 水平。 血清UREA 含量的變化反應(yīng)了動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝情況。 本試驗(yàn)中各處理組異育銀鯽血清UREA 含量均高于對(duì)照組，其中高濃度的鹽堿脅迫組與對(duì)照組差異顯著，說明高濃度的鹽堿脅迫對(duì)異育銀鯽機(jī)體蛋白質(zhì)的代謝有顯著抑制作用。 ALT 和AST 是魚類機(jī)體內(nèi)重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，是氨基酸代謝中不可或缺的酶類，其活性的變化不僅反應(yīng)魚類氨基酸的代謝狀況，而且也從側(cè)面反應(yīng)出魚類肝功能的健康狀況[9]。 本試驗(yàn)中，鹽堿脅迫組血清ALT 及AST 活性均顯著低于對(duì)照組，表明異育銀鯽肝胰臟的代謝功能受到抑制。 LDH 水平的改變直接對(duì)機(jī)體的能量代謝產(chǎn)生影響，組織病變或受損可引起細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致大量LDH 釋放至血液中。 本試驗(yàn)中，不同濃度鹽堿脅迫組異育銀鯽血清LDH 水平顯著高于對(duì)照組，表明其機(jī)體受到鹽堿脅迫所導(dǎo)致的損傷作用。 AKP 參與動(dòng)物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和運(yùn)輸，而且是動(dòng)物解毒體系中重要的一部分。 本試驗(yàn)中，鹽堿脅迫組AKP水平均顯著高于對(duì)照組，表明鹽堿脅迫對(duì)異育銀鯽產(chǎn)生的毒性作用刺激機(jī)體AKP 水平的提高，從而緩解機(jī)體損傷。

3.3 對(duì)肝胰臟抗氧化酶活力指標(biāo)的影響 活性氧自由基(ROS)為動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的一種中間產(chǎn)物，其對(duì)維持基因調(diào)控、細(xì)胞增殖分化及其他生理調(diào)節(jié)起著不可或缺的作用。 鹽堿脅迫會(huì)導(dǎo)致ROS 的生成量超過機(jī)體的負(fù)荷量，并累積于肝臟中，造成核酸損傷、蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化[10]。 SOD 及CAT 作為抗氧化防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶類，通過催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)或?qū)C(jī)體內(nèi)H2O2還原成水，來實(shí)現(xiàn)抗氧化防御減少機(jī)體損傷[11]。 王卓等[12]將耐鹽堿能力較強(qiáng)的青海湖裸鯉暴露32 mmol/L-1和64 mmol/L-1的鹽堿水中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7 d 內(nèi)裸鯉肝胰臟SOD 活力表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。 楊建[13]測(cè)定了10 d 內(nèi)不同濃度鹽堿暴露下大鱗鲃肝組織SOD 及CAT 活性變化，結(jié)果顯示，其活性隨著鹽堿暴露濃度升高及時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。 本試驗(yàn)也得到相同的結(jié)果，相比于對(duì)照組，鹽堿脅迫Ⅱ組SOD 及CAT 活性顯著升高，Ⅲ、Ⅳ組均顯著降低。 表明低濃度的鹽堿脅迫可促使異育銀鯽機(jī)體產(chǎn)生反饋抵抗機(jī)制以應(yīng)對(duì)應(yīng)激反應(yīng)，隨著鹽堿濃度升高，抗氧化酶活性受到抑制，因而對(duì)機(jī)體造成了氧化損傷。