單春蘭， 劉超英， 孫文匯， 富國文， 嚴玉霖， 高 洪

(1. 云南農業(yè)大學動物科技學院， 云南 昆明 650201 ；2. 云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院， 云南 昆明 650201)

Sudan I 是人工合成的親脂性偶氮化合物，常用作工業(yè)染料。 Sudan I 可通過多種途徑進入生物體內，通過胃腸道微生物還原酶、肝臟及肝外組織微粒體和細胞質的細胞色素還原酶系(如細胞色素P450s)等進行代謝[1]。 體內能夠代謝成相應的胺類物質，可滲透機體血紅細胞，對許多器官和組織造成損傷，對機體具有致癌、致突變、致氧化損傷、皮膚過敏等毒性作用。 細胞色素P450s，是一種廣泛存在于生物體內含亞鐵血紅素的超家族蛋白酶，主要有CYP1、CYP2、CYP3 三個基因家族，是生物體內參與內源性化合物(激素、脂肪酸)和外源性化合物(藥物、前致癌物)生物轉化酶系的主要成員，并與腫瘤的發(fā)生密切相關。 丙氨酸氨基轉移酶(ALT)在肝臟組織中含量最為豐富，主要存在于肝細胞的胞漿內，機體受損時可由肝細胞釋放入血液中，使血清中的這種酶活性升高。天冬氨酸氨基轉移酶(AST)主要存在于心肌中，但肝臟中含量也非常高，在肝細胞中，線粒體存在80%，包漿中存在20%。 ALT 和AST 均為非特異性細胞內功能酶，正常機體血清含量很低，當肝細胞受損時，肝細胞膜通透性增加，胞漿內的ALT、AST 釋放入血漿，致使血清ALT、AST 的活性升高[2]。

本試驗擬用空白對照組、Sudan I 處理組實驗動物SD 大鼠，建立肝臟病理性損傷的中毒動物模型，采用半定量RT-PCR 技術和酶成分分析探討CYP450 酶系基因表達以及ALT 和AST 的變化，對認識Sudan I 致肝損傷機理以及建立Sudan I 中毒病理性評價標準等方面提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 蘇丹紅I (Sudan I )，購自國藥集團化學試劑有限公司；TRIZol 試劑、DEPC、 RT-PCR 試劑盒、SYBR-Green Supermix(BIO-RAD)，購自北京全式金生物技術有限公司；DL-2000 Marker，購自云科生物有限公司；Gold view (生物核酸染料)，購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 主要儀器 DANGERSJ-CJ-1F 型超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設備有限公司)；Beckman 超速冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)；UV755B 紫外可見分光光度計(上海分析儀器廠)； Eppendorf PCR儀(德國Eppendorf 公司)；熒光PCR 儀(美國Bio-Rad公司)；DYCP-31BN 電泳槽(北京六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)；FA1004N 型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

1.3 實驗動物分組與處理 30 只清潔級SD 大鼠，體重140 ～160 g/只，雌(無孕)雄不拘，由昆明醫(yī)學院實驗動物科提供。 臨床檢查確認健康后，單籠、顆粒飼料預飼養(yǎng)3 d，自由飲水采食，編號并隨機分為空白對照組(C 組)和Sudan I 處理組(I ， II， III和IV 組)，每組6 只。

將Sudan I 與飼料按一定比例充分混勻配制成顆粒飼料，分別以4 個不同劑量飼喂Sudan I 處理組：I 組(265 mg/kg·bw)、II 組(530 mg/kg·bw)、III 組(795 mg/kg·bw)和IV 組(975 mg/kg·bw)，連續(xù)飼喂10 d。 C 組飼以普通顆粒飼料，飼喂與處理組相同天數(shù)。

1.4 肝臟樣品的采集 末次給藥后，大鼠禁食12 h，處死大鼠后立即剖腹，用已干熱滅菌的鑷子、剪刀剪取150 mg 左右的肝臟分別裝入無菌的凍存管中，擰緊瓶蓋后立即放入液氮中速凍。 然后轉入-80 ℃的超低溫冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 半定量PCR 檢測CYP 亞酶mRNA 的相對表達 本研究以CYC 為內參對照，檢測大鼠肝臟組織中CYP 主要亞型CYP 1A1，CYP 2E1，CYP 3A1 mRNA 表達相對量。 方法為取大鼠肝臟組織30 mg，液氮研磨組織塊，按常規(guī)TRIZol 法提取總RNA。 在核酸定量儀nanodrop 下測定吸光度OD 值，計算RNA 的濃度，RNA 的濃度(μg/μL) =OD260×OD500(核酸稀釋倍數(shù)) × (40/1 000)μg/μL。 以總RNA為模板，按照北京全式金生物技術有限公司cDNA試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA。 半定量RT-PCR 反應加入2 μL cDNA，20 μL 反應體系是10 μL IQ SYBR Green Supermix、正、反義引物各0.5 μL、1.5 μL 的cDNA 摸板，補去離子水至20 μL。 反應條件：預變性94 ℃，3.5 min； 變性94 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s，共40 個循環(huán)；最后72 ℃，延伸10 min。用2-ΔΔCt 法計算實驗組與對照組各基因的相對表達量[3-4]。 半定量RT-PCR 擴增引物參照文獻[5]設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列見表1。

表1 引物及擴增片段長度

1.6 血液樣品的采集 分別按照實驗設定的劑量處理后處死大鼠，摘眼球采集2 mL 血液制備血清，用于ALT 和AST 檢測。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 統(tǒng)計軟件19.0 進行單因素方差分析( ANOVA) 和最小顯著差法(LSD)進行兩兩比較。

2 結果與分析

2.1 半定量分析CYP 1A1、CYP2 E1 和CYP 3A1基因的表達 CYP 1A1、CYP 2E1 和CYP 3A1 基因相對表達量結果，見表2。

從表2 可以看出，半定量RT-PCR 檢測到在C、I ，II， III 組和IV 組CYP 1A1 基因相對表達量分別為1.28、1.71、2.03、2.20 和2.08，表明不同的Sudan I處理組顯著高于C 組(P ＜0.05，P ＜0.01)；在C、I ， II， III 組和IV 組CYP 2E1 基因表達量分別為1.13、1.16、1.55、1.49 和1.31，表明Sudan I 不同處理組顯著高于C 組(P ＜0.05，P ＜0.01)；在C、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組和Ⅳ組基因表達量分別為1.08、1.29、1.31、1.41 和1.40。 t 檢驗結果表明，Sudan I 不同處理組顯著高于C 組(P ＜0.05，P ＜0.01)。 在一定劑量范圍內，CYP 1A1，CYP 2E1 和CYP 3A1 基因的表達量均隨劑量上升而增加。

表2 大鼠肝臟CYP 1A1、CYP 2E1 和CYP 3A1_____________________基因表達量

2.2 CYP1A1、CYP2E1 和CYP3A1 基因的RT-PCR擴增圖 目的基因RT-PCR 電泳產物擴增結果見圖1。

圖1 目的基因RT-PCR 電泳產物擴增結果

從圖3 可以看出，顯示與預期相符，良好的、無拖尾的目的基因條帶。

2.3 ALT、AST 活性的變化情況 大鼠血清中ALT、AST 活性的測定結果見表3。

從表3 可以看出，本試驗結果顯示，ALT 活性在C、I ， II， III 組和IV 組分別為48、70、75、97 和137。t 檢驗結果表明，Sudan I 處理組顯著高于C 組(P ＜0.05，P ＜0.01)。 AST 活性在C、I ， II， III 組和IV組分別為106、155、198、409 和938。 t 檢驗結果表明，Sudan I 處理組顯著高于C 組(P ＜0.05，P ＜0.01)。 且在一定范圍內，隨著Sudan I 劑量的增加，ALT、AST 活性有明顯升高的趨勢。

表3 Sudan I 對大鼠血清中ALT、AST 活性的變化

3 討論

3.1 蘇丹紅I 對CYP1A1 基因表達的影響 CYP 1A1 可以將外源物質轉變?yōu)橛H電子化合物，該親電子化合物可攻擊細胞內的生物大分子，與DNA 或蛋白質形成加合物，最終引起P450 酶系所在的靶器官肝臟發(fā)生損傷[6]。 有研究發(fā)現(xiàn)，CYP 1A1 在許多癌癥發(fā)病學中發(fā)揮著一定作用，CYP 1A1 表達水平被認為是化學致癌作用的一種潛在指標。 CYP 1A1活性只有在某些誘導劑，如二噁英、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等誘導后表達水平較高，其誘導機制與芳香烴受體有關，芳香烴受體可高度誘導增加CYP 1A1 基因的表達而增加CYP 1A1 的活性，生成環(huán)氧化合物攻擊大分子物質，導致肝臟的損傷[7]。

本研究通過半定量RT-PCR 法分析CYP 1A1基因表達情況結果顯示，CYP 1A1 基因在C 組和Sudan I 處理組均有表達，且二組定量方法的檢驗結果一致，均表明不同的SudanⅠ處理組顯著高于C組，且在一定劑量范圍內表現(xiàn)為上升趨勢。 但是在Ⅳ組表現(xiàn)為下降，分析認為機體本身是一個復雜的大系統(tǒng)，肝損傷時代謝調控可能發(fā)生了變化。 王婷等[9]將懷孕大鼠暴露于煙霧中，提取肝臟和胎盤總RNA，半定量RT-PCR 法分析肝臟和胎盤CYP 1A1基因的表達變化。 結果顯示，肝臟CYP 1A1 基因表達和胎盤CYP 1A1 基因表達均高于正常C 組，表明香煙中所含多環(huán)芳烴類物質及尼古丁等有毒物質增加對機體肝臟的損傷。 可見在代謝外源毒物過程中，CYP 1A1 處于重要位置。

3.2 蘇丹紅I 對CYP 2E1 基因表達的影響 CYP2家族細胞色素CYP 2E1 在體內負責6 大類、70 余種低分子化學物質的代謝，包括苯胺、乙醇、丙酮、氨基甲酸乙酯以及亞硝胺類化合物等[10]。 有些外源毒物可經CYP 2E1 代謝，代謝生成肝毒性的活性中間產物，導致了肝細胞的基因表達，啟動膜的脂質過氧化，導致胞內外的Ca2+濃度平衡狀態(tài)發(fā)生改變，破壞機體重要的抗氧化物質谷胱甘肽，從而引起肝臟細胞的損傷[11]。 采用半定量PCR 法分析CYP 2E1 基因的表達情況結果顯示，CYP 2E1 基因在C 組和Sudan I 處理組均有表達，Sudan I 不同處理組顯著高于C 組，且在一定劑量范圍內CYP 2E1基因的表達呈現(xiàn)為上升趨勢。 但在Ⅲ組表現(xiàn)為下降，分析認為機體本身是一個復雜的大系統(tǒng)，肝損傷時代謝調控可能發(fā)生了變化。 王愛紅等[12]將氯乙烯染毒大鼠，觀察肝CYP 2E1 活力和基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)隨著氯乙烯染毒劑量的增加，大鼠肝臟中CYP2E1 活性和基因表達量也隨之增加，結果顯示了氯乙烯促使CYP2 E1 基因表達的增加，導致了肝細胞的基因表達，啟動膜的脂質過氧化，導致胞內外的Ca2+濃度平衡狀態(tài)發(fā)生改變，破壞機體重要的抗氧化物質谷胱甘肽，從而引起肝臟細胞的損傷。

3.3 蘇丹紅I 對CYP 3A1 基因表達的影響 CYP 3A1 是CY P450 基因家族中最重要的代謝酶基因，其在許多毒理學和藥物代謝方面具有重要意義[13]。CYP 3A1 在藥物代謝、環(huán)境中有害物質的代謝及內源性類固醇激素的代謝中，它是一種重要的單氧化酶，它能被多種化合物所誘導，也能被多種化合物所抑制。 這種酶的活性影響著外源物的血液濃度、代謝過程，從而對外源物的安全性和毒副作用產生影響。 有報道發(fā)現(xiàn)，如果CYP 3A1 活性被誘導增加，可導致生殖系統(tǒng)的毒性作用[14]。 采用半定量RT-PCR 法分析CYP 3A1 基因表達量情況，t 檢驗結果表明，Sudan I 不同處理組顯著高于C 組，且在一定劑量范圍內CYP 3A1 基因的表達呈現(xiàn)為上升趨勢。 但在Ⅳ組表現(xiàn)略有下降，分析認為機體本身是一個復雜的大系統(tǒng)，肝損傷時代謝調控可能發(fā)生了變化。 由此可見，CYP 3A1 誘導作用影響了Sudan I在血液濃度的代謝速度，對機體產生了影響，而發(fā)揮Sudan I 的毒性效應。

3.4 蘇丹紅Ⅰ對ALT 和AST 活性的影響 ALT、AST 是反映肝臟損傷的最重要的生化指標，ALT 在肝臟組織中含量最豐富，損傷時可由肝細胞釋放入血液中，使血清中的這種酶活性升高。 AST 主要存在于心肌中，但肝臟中含量也非常高，當肝細胞受損時，肝細胞膜通透性增加，胞漿內的ALT、AST 釋放入血漿，致使血清ALT、AST 的活性升高。

本試驗結果表明，Sudan I 處理組ALT、AST 活性顯著高于C 組，且隨著劑量的增加，兩者活性有明顯升高的趨勢。 谷長勤等[15]在黃曲霉毒素導致雛鴨中毒肝損傷的實驗報道中采用測定血清AST、ALT 水平來探討黃曲霉毒素對雛鴨中毒損傷程度。同樣本試驗也采用測定血清AST、Sudan I 對大鼠肝臟細胞損傷的程度。 通過結果，我們可以分析出當Sudan I 進入機體后，隨血液入肝臟后，致胞漿內轉氨酶釋放，故血清ALT 水平明顯升高，隨著時間的增加，肝細胞病變加劇，大量的肝細胞使線粒體內結合的AST 釋放，故血清內AST 活性也明顯升高，因而導致了機體肝臟損傷。