孫 彬， 劉寶濤， 鄒 明， 劉煥奇

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 山東 青島 266109)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus )是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要病原菌之一，占到奶牛乳房炎中病原體的50%以上，是奶牛臨床上最難治療，并且造成經(jīng)濟(jì)損失最大的致病菌。 另外，金黃色葡萄球菌還是一種人獸共患菌，能夠通過(guò)乳制品等食物傳遞給人類，可引起人的尿路感染、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、腸炎等，同時(shí)也是造成食物中毒的常見(jiàn)致病菌之一[1-2]，嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生食品安全。

目前，用抗生素仍是治療S. aureus 感染的主要措施，但隨著抗生素的過(guò)量及高頻率的使用、甚至濫用，使其耐藥譜不斷增大，出現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等多類抗生素耐藥現(xiàn)象，包括重要的人醫(yī)用藥萬(wàn)古霉素都出現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌的耐藥菌株，并且對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)有逐年增高的趨勢(shì)[3-4]，使得細(xì)菌耐藥性問(wèn)題更加突出和復(fù)雜。 食源性細(xì)菌能夠?qū)⒛退幮詡鬟f給人類，對(duì)于臨床治療奶牛乳房炎和人類健康帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)和隱患。 青島地區(qū)奶牛養(yǎng)殖量大，用藥情況復(fù)雜，并且與其相關(guān)的報(bào)道較少，本研究通過(guò)對(duì)青島地區(qū)奶牛場(chǎng)進(jìn)行S. aureus 的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，為指導(dǎo)治療奶牛乳房炎的合理用藥提供參考依據(jù)，為食品安全保障提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 對(duì)青島地區(qū)14 個(gè)奶牛場(chǎng)進(jìn)行樣品的采集，分別采取奶樣613 份、鼻拭子476 份、奶牛場(chǎng)飲水32 份、污水51 份及土壤樣品60 份，共計(jì)1 232 份樣品。 所采樣品放入冰盒中，3 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。 牛乳樣品：對(duì)乳頭進(jìn)行消毒后，棄三把奶后取奶樣置于滅菌的10 mL 離心管中編號(hào)，保存?zhèn)溆茫槐鞘米訕悠罚河脺缇拿藓炚喝∧膛５谋且?，放入裝有7.5% NaCl LB 的5 mL 離心管中編號(hào)，保存?zhèn)溆?；飲水、污水及土壤樣品：用滅菌?0 mL 離心管對(duì)不同牛舍的飲水及污水進(jìn)行采集，對(duì)牛場(chǎng)的不同區(qū)域進(jìn)行土壤樣品的采集。

1.2 試劑與藥品 Baird-Parker 瓊脂基礎(chǔ)、MH 肉湯、MH 瓊脂、LB 肉湯和亞碲酸鹽卵黃增菌液，均購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌生化微量鑒定管，購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Taq 酶、Marker，購(gòu)自TaKaRa 試劑公司；藥敏試驗(yàn)藥物(青霉素、苯唑西林、頭孢西丁、萬(wàn)古霉素、慶大霉素、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、利福平、甲氧芐啶、氨芐西林、頭孢噻呋、泰妙菌素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、利奈唑胺、氯霉素)，購(gòu)自上海麥克林試劑公司。

1.3 方法

1.3.1 增菌培養(yǎng) 將采集的鼻拭子置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 ～24 h；將奶樣以4 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入7.5% NaCl LB 吹勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 ～24 h；分別吸取100 μL 的飲水和污水加入到7.5% NaCl LB 中吹勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 ～24 h；向土壤中加入LB 肉湯，放置5 ～10 min，吸取上清加入到7.5% NaCl LB 中吹勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 ～24 h。

1.3.2 分離培養(yǎng) 將各種樣品的增菌液劃線接種于Baird-Parker 瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)20 ～24 h 后，觀察其菌落形態(tài)特征。

1.3.3 純化培養(yǎng) 在Baird-Parker 平板上挑取疑似菌落進(jìn)行純化，重復(fù)兩次然后進(jìn)行革蘭染色。 純化后，進(jìn)行增菌及保菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 血漿凝固酶試驗(yàn) 接種肉湯培養(yǎng)物于兔血漿中，充分混合，37 ℃培養(yǎng)，每30 min 觀察1 次，將安瓿瓶倒置或傾斜，內(nèi)容物不流動(dòng)為陽(yáng)性，若2 h 后無(wú)上述現(xiàn)象，則放置過(guò)夜后再觀察。

1.3.5 PCR 鑒定 參考文獻(xiàn)[5]，根據(jù)S. aureus 的特異性基因—耐熱核酸酶基因nuc 合成引物，引物序列如下nuc F：5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′；nuc R：5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′。采用CTAB- NaCl 法提取細(xì)菌組DNA，進(jìn)行PCR 檢測(cè)。 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度270 bp。 反應(yīng)體系25 μL：水18.375 μL，PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，Taq 酶0.125 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s 30 個(gè)循環(huán)，再延伸5 min。

1.3.6 藥敏試驗(yàn) 金黃色葡萄球菌ATCC 29213作為藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌株。 對(duì)PCR 鑒定得到的S. aureus 根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)采用瓊脂稀釋法對(duì)青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA)、頭孢西丁(FOX)、萬(wàn)古霉素(VAN)、慶大霉素(GEN)、紅霉素(ERY)、克林霉素(CLI)、左氧氟沙星(OFL)、利福平(RIF)、甲氧芐啶(TRI)、氨芐西林(AMP)、頭孢噻呋(CEF)、泰妙菌素(TIA)、恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)、四環(huán)素(TET)、利奈唑胺(LZD)、氯霉素(CHL)18 種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，獲得其MIC 值，判斷藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 分離純化結(jié)果 采集樣品經(jīng)分離純化后，在BP 瓊脂上呈現(xiàn)圓形、凸起、灰色或黑色、有光澤、周圍伴有沉淀環(huán)的菌株挑選為疑似菌株，共計(jì)78 株。

2.2 凝固酶試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)78 株疑似菌株進(jìn)行凝固酶試驗(yàn)，有59 株呈現(xiàn)凝固酶陽(yáng)性。

2.3 PCR 鑒定結(jié)果 經(jīng)PCR 鑒定，59 株凝固酶陽(yáng)性菌株均擴(kuò)增出270 bp 大小的目的片段，鑒定結(jié)果如圖1，由于菌株較多，只挑選幾株菌的電泳圖，并隨機(jī)挑選部分菌株進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果進(jìn)行BLAST，相似度高于99%確定為金黃色葡萄球菌。 從不同樣品的分離結(jié)果可以看出(見(jiàn)表1)，59 株金黃色葡萄球菌在奶樣中的分離率為5.5%(34/613)，在鼻拭子中的分離率為3.6%(17/476)，在飲水中的分離率為6.3%(2/32)，在污水中的分離率為5.9%(3/51)，在土壤中的分離率為5%(3/60)。

從不同養(yǎng)殖場(chǎng)的分離結(jié)果看，59 株金黃色葡萄球菌來(lái)自14 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中的7 個(gè)場(chǎng)，陽(yáng)性場(chǎng)率為50%，其中有6 個(gè)場(chǎng)的分離率介于3.5%-12.9%之間，差別不等，另外1 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的分離率為33.8%，差別明顯，其分離率見(jiàn)表2。

圖1 nuc 基因(270 bp)的瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 不同樣品的分離率

表2 14 個(gè)奶牛場(chǎng)的S. aureus 分離率/%(陽(yáng)性數(shù)/樣品數(shù))

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 59 株金黃色葡萄球菌除對(duì)氯霉素表現(xiàn)為全部敏感外，對(duì)其他17 種藥物(共12 類抗菌藥物)均出現(xiàn)了不同程度的耐藥，其中以2 耐為主，占分離菌株的40.7%，3 耐及3 耐以上菌株占分離菌株的42.5%，有1 株耐藥菌表現(xiàn)出對(duì)10 類抗生素耐藥，多重耐藥結(jié)果見(jiàn)表3。

59 株金黃色葡萄球菌對(duì)氨芐西林耐藥率最高，為86.4%，對(duì)青霉素、苯唑西林和甲氧芐啶耐藥率較高，分別為71.2%、74.6%和74.6%，對(duì)紅霉素的耐藥率為44.1%，對(duì)第2 代頭孢菌素類頭孢西丁的耐藥率為30.5%，對(duì)第3 代動(dòng)物專用頭孢菌素頭孢噻呋和慶大霉素的耐藥率較低，都為3.4%。 本試驗(yàn)檢測(cè)到重要的人醫(yī)臨床用藥萬(wàn)古霉素和利奈唑胺耐藥菌株，耐藥率分別為8.5%(5/59)和10.2%(6/59)，從分離出萬(wàn)古霉素和利奈唑胺耐藥菌株的陽(yáng)性場(chǎng)情況看，萬(wàn)古霉素耐藥細(xì)菌陽(yáng)性場(chǎng)占全部采樣場(chǎng)的14.3%(2/14)，且分離得到的5 株萬(wàn)古霉素耐藥菌株均來(lái)自牛乳樣品中，利奈唑胺耐藥細(xì)菌陽(yáng)性場(chǎng)占全部采樣場(chǎng)的21.4%(3/14)，6 株利奈唑胺耐藥菌株分別來(lái)自污水3 株、牛乳樣品2 株和土樣1 株，具體耐藥情況見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 金黃色葡萄球菌的分離率分析 本試驗(yàn)通過(guò)微生物學(xué)方法及PCR 鑒定，從1 232 份樣品中分離出59 株金黃色葡萄球菌，分離率為4.8%，其中共采集奶樣613 份，分離出34 株金黃色葡萄球菌，分離率為5.5%，明顯低于劉文進(jìn)報(bào)道[6]的金黃色葡萄球菌分離率78.98%，并且從表2 中可以看出，場(chǎng)3 與其他各場(chǎng)的分離率相差較大，并且飲水和土壤中都分離得到金黃色葡萄菌，可見(jiàn)其污染嚴(yán)重，這可能與奶牛場(chǎng)的飼養(yǎng)管理、養(yǎng)殖環(huán)境條件有關(guān)，因此應(yīng)該注意養(yǎng)殖場(chǎng)的環(huán)境，完善其管理制度，提高工作人員的防污染意識(shí)以及擠奶人員的熟練度。

在污水、飲水及土壤中分離出來(lái)的金黃色葡萄球菌可能是引起奶牛感染的一條重要途徑，需要進(jìn)一步的研究。 本試驗(yàn)使用PCR 方法，根據(jù)金黃色葡萄球菌特有的耐熱核酸酶基因(nuc)，在該菌DNA片段中為高保守的序列[7]，查找引物進(jìn)行鑒定，該方法具有較好的特異性、快速敏捷、操作方便，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于致病菌的檢測(cè)中[8-9]。

表3 59 株金黃色葡萄球菌的多重耐藥情況

表4 59 株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果___________________________________

3.2 金黃色葡萄球菌的藥物敏感性分析 隨著抗生素的長(zhǎng)期使用，使得耐藥菌大量出現(xiàn)，造成許多常用抗生素降低甚至失去其治療效果。 本研究表明，分離得到的59 株金黃色葡萄球菌除了10 株菌只對(duì)一類抗生素(1 株對(duì)利福霉素類，6 株對(duì)β-內(nèi)酰胺類，3 株對(duì)磺胺類)耐藥，其余各菌都具有較廣的耐藥譜，三耐及三耐以上菌株占所有菌株的42.5%，其中有1 株對(duì)10 類抗生素耐藥，說(shuō)明本試驗(yàn)獲得的菌株多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，應(yīng)該注意合理科學(xué)用藥，避免抗生素的濫用和超劑量使用，以免到時(shí)出現(xiàn)無(wú)藥可醫(yī)的現(xiàn)象。

59 株金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素、氨芐西林、甲氧芐啶及苯唑西林耐藥率較高，分別為71.2%、86.4%、74.6%和74.6%，低于王冰[10]報(bào)道的青霉素G(99.5%)，氨芐西林(100%) 和甲氧芐啶(100%)，高于劉敬蘭[11]報(bào)道的苯唑西林耐藥率(49%)。 對(duì)慶大霉素和頭孢噻呋的敏感性也很高，均為96.6%，與錫林高娃等[12]報(bào)道的慶大霉素敏感性(100%)和J. G. Rola[13]報(bào)道的頭孢噻呋敏感性(100%)相接近，對(duì)第二代頭孢菌素類頭孢西丁的耐藥率為30.5%，要高于劉敬蘭[11]報(bào)道的頭孢西丁耐藥率(17%)，對(duì)氯霉素的敏感性最高，為100%。

如上所述，59 株金黃色葡萄球菌對(duì)常用藥物表現(xiàn)出不同程度耐藥，并且對(duì)分離出金黃色葡萄球菌的7 個(gè)奶牛場(chǎng)的用藥史進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)7 個(gè)場(chǎng)均長(zhǎng)期使用β-內(nèi)酰胺類藥物，并且有3 個(gè)場(chǎng)還經(jīng)常使用紅霉素，對(duì)于其他抗菌藥物使用較少，這種頻繁的使用單一抗菌藥物對(duì)致病菌已沒(méi)有明顯的效果，所以為減緩耐藥菌株的出現(xiàn)，可以考慮對(duì)金黃色葡萄球菌病的治療采用聯(lián)合用藥和輪轉(zhuǎn)用藥。

值得注意的是，萬(wàn)古霉素作為人類對(duì)付頑固性耐藥細(xì)菌的“最后一道防線”及重要的人醫(yī)用藥，可以通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的磷脂和多肽來(lái)干擾細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，并且不易和其他抑制細(xì)菌蛋白合成的抗菌藥物產(chǎn)生交叉耐藥，具有無(wú)交叉耐藥性特點(diǎn)，很少出現(xiàn)耐藥菌株，因此對(duì)于治療多重耐藥革蘭陽(yáng)性球菌引起的感染很有效果，并且是治療MRSA 感染的一線用藥。 在本研究中共分離得到5株耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌(Vancomycin resistant S， aureus， VRSA)，且均來(lái)自奶樣品中，雖然其耐藥率為8.5%(5/59)，相比其他抗生素耐藥率而言較低，但也存在人與動(dòng)物之間進(jìn)行傳播的可能性以及將耐藥性通過(guò)奶制品傳遞給人類的風(fēng)險(xiǎn)性，發(fā)展成為重要的公共衛(wèi)生隱患，所以應(yīng)該了解VRSA 的分布及耐藥情況，找出導(dǎo)致VRSA 的感染途徑，控制其感染并指導(dǎo)合理用藥，不斷提高VRSA 的防治水平。

利奈唑胺屬于 惡唑烷酮類化學(xué)合成的抗生素，我國(guó)于2007 年9 月僅批準(zhǔn)用于人醫(yī)臨床治療MRSA 等，對(duì)于多重耐藥革蘭陽(yáng)性球菌的感染，并未批準(zhǔn)用于獸醫(yī)臨床，但本研究中確檢測(cè)到利奈唑胺耐藥菌株，其耐藥率為10.2%(6/59)，一方面可能是因?yàn)樵谑褂美芜虬窌r(shí)未按照要求，將其直接用于奶牛疾病的治療，導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生；另一方面，介導(dǎo)利奈唑胺耐藥的cfr 基因大多數(shù)位于質(zhì)粒上，可在不同種細(xì)菌或不同屬細(xì)菌間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，在臨床分離細(xì)菌之間、甚至動(dòng)物來(lái)源細(xì)菌以及環(huán)境細(xì)菌之間相互傳播，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。