李凌云，許曉敏，林 桓，錢 洪，黃曉冬，劉廣洋，鄭姝寧，徐東輝*，裴志國

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所 農(nóng)業(yè)部蔬菜質(zhì)量安全控制重點實驗室 農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京 100081；2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學與生態(tài)毒理學國家重點實驗室，北京 100085)

除蟲菊素是從除蟲菊中提取出的植物源性農(nóng)藥，具有高效、廣譜、低毒、不易產(chǎn)生抗性等特點，因此被廣泛應(yīng)用于衛(wèi)生殺蟲領(lǐng)域[1-2]。除蟲菊素由6個結(jié)構(gòu)極相似的化合物組成[3]，即除蟲菊素Ⅰ(Pyrethrin Ⅰ)、除蟲菊素Ⅱ(Pyrethrin Ⅱ)、瓜葉菊素Ⅰ(Cinerin Ⅰ)、瓜葉菊素Ⅱ(Cinerin Ⅱ)、茉酮菊素Ⅰ(Jasmolin Ⅰ)和茉酮菊素Ⅱ(Jasmolin Ⅱ)。其中除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ的含量最高，其它4種化合物的含量相對較低。

除蟲菊素的殘留問題正逐漸引起重視。如我國新版的《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》GB2763-2016中新增了除蟲菊素的殘留限量，規(guī)定大白菜中除蟲菊素的最大殘留限量為1.0 mg/kg。但該標準并未給出可以依據(jù)或參照的檢測方法。另外該標準規(guī)定除蟲菊素的殘留量以除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ之和計算。然而除蟲菊素包括6個組分，對每個組分進行快速準確的定性定量分析，對于真實反映除蟲菊素的殘留現(xiàn)狀，確保人們的食品安全非常重要。

目前報道的除蟲菊素殘留檢測方法有液相色譜法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-6]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-12]，基質(zhì)主要涉及土壤[7]、茶葉[8]、嬰兒食品[9]、食品[5,10-12]等。而采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測蔬菜中除蟲菊素殘留的研究較少。雖然有些多殘留檢測對象中包括除蟲菊素，但僅涉及除蟲菊素的某個成分，并不能滿足檢測需要。如國標GB/T 20769-2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中包括除蟲菊素，但只有除蟲菊素Ⅰ，未包括其他5個組分。

液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(HPLC-MS/MS)具有分離效果好、靈敏度高、抗干擾能力強、選擇性好等優(yōu)點，目前已成為農(nóng)殘檢測的首選方法[13-15]。本研究利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了蔬菜樣品中除蟲菊素6個組分的快速檢測方法。蔬菜樣品經(jīng)乙腈提取，提取液無需凈化，過濾膜后直接上機測定。該方法簡單、快速、回收率高，適用于大批量蔬菜樣品的篩查檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-30A超高效液相色譜儀和LC-MS/MS-8050三重四極桿質(zhì)譜儀均購自日本Shimadzu公司。

乙腈、甲醇(HPLC級，美國JT Baker公司)；乙酸銨(HPLC級，美國Fluka公司)；甲酸(HPLC級，Dikma科技)；純凈水(Milli-Q超純水儀制備)；除蟲菊素標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司)中各成分含量為：除蟲菊素Ⅰ(51.7%)、除蟲菊素Ⅱ(33.7%)、瓜葉菊素Ⅰ(4.8%)、瓜葉菊素Ⅱ(4.7%)、茉酮菊素Ⅰ(2.9%)、茉酮菊素Ⅱ(1.8%)；其他試劑均為分析純，購自北京化學試劑公司。

1.2 樣品處理

稱取10.0 g蔬菜試樣于50.0 mL離心管中，加入20.0 mL乙腈，振蕩提取30.0 min后，加入5.0 g氯化鈉，劇烈振蕩1.0 min，以5 000 r/min離心3.0 min后，取上層乙腈相，過0.22 μm濾膜,濾液待測。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH HSS C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流動相：A為乙腈；B為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫條件：0～10 min，60%～80%A；10～10.1 min，80%～100%A；10.1 ～15 min，100%A；15～15.1 min，100%～60%A；15.1～20 min，60%A；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

ESI離子源；接口電壓4 000 V；正離子掃描；MRM監(jiān)測模式；霧化氣(氮氣)流速3 L/min，干燥氣(氮氣)流速10 L/min，加熱氣(空氣)流速10 L/min；接口溫度300 ℃；脫溶劑管溫度250 ℃；加熱模塊溫度400 ℃；碰撞氣(氬氣)壓力2.7×105Pa。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將除蟲菊素配制成100 μg/L的標準溶液。優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)時，將除蟲菊素標準溶液在不接色譜柱的情況下直接通過液相色譜注入質(zhì)譜。以甲醇-水(50∶50，體積比)為流動相時，只能得到除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ的[M+H]+離子，分別為m/z329.2和373.2，瓜葉菊素Ⅰ、瓜葉菊素Ⅱ、茉酮菊素Ⅰ、茉酮菊素Ⅱ 的母離子不易找到。而以乙腈-水(50∶50)為流動相時，這4個化合物的母離子分別為m/z317.2、361.2、331.2和375.2，且碎片離子相對穩(wěn)定。在得到6個化合物的母離子[M+H]+后，利用儀器自動優(yōu)化功能，篩選二級碎片離子，獲得碎片離子信息及質(zhì)譜參數(shù)Q1(Quadrupole 1)、Q3(Quadrupole3)和碰撞能量(CE)。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

另外，由于除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ，瓜葉菊素Ⅰ和瓜葉菊素Ⅱ，茉酮菊素Ⅰ和茉酮菊素Ⅱ每對化合物的結(jié)構(gòu)非常相似，因此它們具有相同的碎片離子。例如除蟲菊素Ⅰ和Ⅱ具有相同的碎片離子m/z161和133，瓜葉菊素Ⅰ和Ⅱ的碎片離子為m/z107和77，而茉酮菊素Ⅰ和Ⅱ的碎片離子為m/z163和107。

2.2 流動相的優(yōu)化

如上所述，相比甲醇-水流動相，6個除蟲菊素在乙腈-水作為流動相時的質(zhì)譜響應(yīng)更好。因此本實驗采用乙腈作為流動相中的有機相。另外考察了在水相中分別添加0.1%甲酸、1.0 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸-1.0 mmol/L乙酸銨對色譜分離及靈敏度的影響，發(fā)現(xiàn)3種添加劑對除蟲菊素的色譜峰形及分離的影響差別不大，但添加少量的甲酸后，各化合物的離子化效率更高，靈敏度更好，且添加甲酸的效果好于添加乙酸銨。因此本實驗最終采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

圖1 大白菜空白基質(zhì)中除蟲菊素標準溶液的MRM總離子流圖(0.1 mg/L)Fig.1 Total ion chromatogram of China cabbage blank matrix spiked with pyrethrins standard solution at 0.1 mg/L in MRM mode1.cinerin Ⅱ;2.pyrethrin Ⅱ;3.jasmolin Ⅱ;4.cinerinⅠ;5.pyrethrinⅠ;6.jasmolinⅠ

在色譜分離時，瓜葉菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅰ，瓜葉菊素Ⅱ和除蟲菊素Ⅱ的分離比較困難。為此本實驗對梯度洗脫條件進行了優(yōu)化，最終使6個化合物得到完全分離(圖1)。6種化合物的保留時間分別為4.110、4.297、5.280、7.488、7.676、9.083 min。

2.3 提取方式的優(yōu)化

本實驗考察了振蕩器振蕩、均質(zhì)和超聲3種提取方式對除蟲菊素提取效率的影響。結(jié)果表明，3種提取方式對6種除蟲菊素的回收率影響差別不大，回收率分別為91.0%～101.8%、94.3%～104.5%、93.4%～102.4%。由于振蕩提取可批量處理樣品，節(jié)省實驗時間，因此本實驗采用振蕩器振蕩提取。

2.4 提取溶劑的選擇

本實驗分別比較了提取溶劑丙酮、乙酸乙酯、正己烷和乙腈對6種除蟲菊素回收率的影響。結(jié)果顯示，丙酮和乙腈的提取率優(yōu)于正己烷和乙酸乙酯。以正己烷提取時，6種化合物的回收率為47.4%～103.7%，瓜葉菊素Ⅰ、除蟲菊素Ⅰ、茉酮菊素Ⅰ的回收率較低，分別為66.7%、59.1%和47.4%。以乙酸乙酯提取時，6種化合物的回收率為57.3%～81.4%，瓜葉菊素 Ⅱ、除蟲菊素Ⅱ、茉酮菊素 Ⅱ的回收率較低，分別為63.3%、63.3%和57.3%。而以丙酮和乙腈提取時，6種化合物的回收率分別為69.8%～97.6%和86.2%～99.5%。相比較而言，乙腈提取得到的結(jié)果最好，因此本實驗最終選擇乙腈作為提取溶劑。

圖2 除蟲菊素在蔬菜中的基質(zhì)效應(yīng)(0.1 mg/L )Fig.2 Matrix effects of pyrethrins at 0.1 mg/L in vegetable matrices

2.5 基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)中的共提取干擾物質(zhì)影響目標化合物的離子化，從而使目標化合物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生增強或抑制的現(xiàn)象。因此在進行農(nóng)殘測定時，對目標化合物在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)進行評價是非常重要的。本文采用較為常用的相對響應(yīng)值法評價基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)=(B/A-1)×100%[16]，A為純?nèi)軇┲谢衔锏捻憫?yīng)值，B為蔬菜基質(zhì)中添加相同濃度農(nóng)藥的響應(yīng)值。實驗考察了0.05、0.1、0.5 mg/L 3個水平下6種化合物在番茄、黃瓜、甘藍、大白菜、菠菜和油菜6種蔬菜基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，0.05 mg/L水平下，基質(zhì)效應(yīng)為-11.2%～13.0%；0.1 mg/L水平下，基質(zhì)效應(yīng)為-4.1%～12.6%；0.5 mg/L水平下，基質(zhì)效應(yīng)為-8.5%～6.0%。3個水平下，6種化合物基質(zhì)效應(yīng)的絕對值均小于15%，屬于弱基質(zhì)效應(yīng)，對測定結(jié)果影響較小。圖2為除蟲菊素在蔬菜中0.1 mg/L水平的基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 方法的線性關(guān)系與定量下限

用菠菜、油菜、甘藍、番茄、黃瓜和大白菜6種空白基質(zhì)溶液，準確配制1.0、5.0、10、25、50、100、250、500、1 000 μg/L的系列混合標準工作溶液，按優(yōu)化實驗條件進行LC-MS/MS測定。以峰面積(y)對相應(yīng)質(zhì)量濃度(x,μg/L)作標準曲線，得到6種農(nóng)藥的線性方程，各農(nóng)藥的線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表1。所有農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 5～0.999 9。其中除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ的線性范圍為1～1 000 μg/L，瓜葉菊素Ⅰ、瓜葉菊素Ⅱ、茉酮菊素Ⅰ和茉酮菊素Ⅱ的線性范圍為10～1 000 μg/L。

表1 6種化合物的保留時間、MRM離子對、碰撞能量、線性范圍、相關(guān)系數(shù)與定量下限(LOQs)Table 1 Retention times(tR),MRM transitions,collision energies,linear ranges,correlation coefficients and LOQs of six compounds

* quantitative ions

定量下限(LOQ)采用加標回收進行驗證，符合一定的準確度和精密度要求的最低加標濃度，確定為定量下限，定量下限是指除蟲菊素總量。表1結(jié)果顯示，除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ的LOQ為0.01 mg/kg，其他4種化合物的LOQ為0.05 mg/kg。除蟲菊素的LOQ低于GB 2763-2016最大殘留限量要求。

2.7 方法的回收率與精密度

本文采用基質(zhì)匹配標準溶液外標法定量。在菠菜、油菜、甘藍、番茄、黃瓜和大白菜6種基質(zhì)中對除蟲菊素進行加標回收率實驗，加標水平為0.05、0.1、0.5 mg/kg，每個加標水平重復6次。結(jié)果如表2所示，6種物質(zhì)的平均回收率為73.9%～109.3%，相對標準偏差(RSD)為0.4%～7.7%。方法的準確度和精密度均符合殘留分析的要求。另外，由于除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ的LOQ為0.01 mg/kg，比其它4種化合物的LOQ(0.05 mg/kg)低，因此還對除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ進行了0.01 mg/kg添加水平的回收率實驗，結(jié)果見表2。

表2 方法加標回收率和精密度(n=6)Table 2 Spiked recoveries and precisions of the method(n=6)

(續(xù)表2)

VegetableSpiked(mg/kg)Recovery(RSD)/%CinerinⅡPyrethrinⅡJasmolinⅡCinerinⅠPyrethrinⅠJasmolinⅠ0.193.9(4.9)90.3(1.1)92.9(4.4)91.1(2.8)93.5(0.5)94.6(2.5)0.591.0(1.2)91.0(0.6)90.7(1.6)92.8(2.5)91.0(0.4)91.1(1.2)Cabbage0.0194.9(6.4)100.1(5.5)0.0599.1(4.8)98.0(1.8)84.5(4.5)91.1(4.5)96.6(0.6)95.6(4.5)0.192.5(3.1)92.9(1.7)83.7(7.0)87.9(4.8)89.6(1.3)78.9(1.1)0.594.2(2.7)92.5(1.4)94.6(3.9)91.2(1.2)91.4(1.2)91.7(0.8)Tomato0.0197.2(3.6)101.8(2.9)0.0596.0(4.5)95.2(3.0)84.4(3.0)92.6(2.0)90.6(2.1)88.9(5.2)0.188.9(5.3)90.2(1.7)85.5(3.1)92.6(3.4)88.9(1.9)84.2(2.3)0.590.9(1.0)92.2(1.1)93.3(2.9)92.0(1.1)90.1(0.6)91.2(1.3)Cucumber0.0185.8(5.4)97.4(3.7)0.0595.8(4.4)94.4(1.9)109.3(6.7)93.8(5.1)94.1(0.8)91.8(3.9)0.194.5(3.7)91.9(1.6)92.2(3.6)90.8(3.5)91.1(2.4)89.7(4.4)0.589.7(1.6)92.1(0.9)92.2(2.2)93.2(1.4)92.4(0.6)91.6(1.4)Chinesecabbage0.01102.9(10.9)93.5(4.7)0.0597.7(3.3)98.6(2.4)97.1(4.6)95.9(5.5)98.3(1.3)94.0(4.1)0.192.8(2.4)90.6(0.9)90.4(5.4)91.5(3.6)91.8(1.3)85.7(5.5)0.594.1(1.2)94.5(0.7)92.8(0.9)97.2(1.1)94.3(0.9)94.3(1.1)

2.8 實際樣品的測定

應(yīng)用所建立的方法對超市和市場上購買的300個菠菜和油菜樣品進行檢測，結(jié)果顯示，樣品中均未檢出除蟲菊素殘留。

3 結(jié) 論

本文采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立了蔬菜中除蟲菊素的快速定性、定量檢測方法。樣品經(jīng)乙腈提取，鹽析萃取后無需凈化，直接上機分析，縮短了樣品前處理的時間。該方法簡便、快速、靈敏，回收率高，適用于蔬菜樣品中除蟲菊素的快速檢測，并成功應(yīng)用于實際樣品的測定。

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