樊磊，曹繼軍，張英杰，劉穎，張治然，襲榮剛，王曉波,*

1. 中國人民解放軍第210醫(yī)院藥學部，大連 116021 2. 遼東學院，丹東 118001

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，環(huán)境污染已成為社會發(fā)展和人民健康水平提高的制約因素，特別是大氣污染帶來的健康問題已日益嚴峻。大氣污染物成分復雜，隨著汽車保有量的增加，汽車尾氣污染已逐漸代替工業(yè)廢氣污染，成為我國城市大氣污染的首要因素[1]。汽車尾氣中的主要污染物為碳氫化合物、氮氧化合物、一氧化碳、二氧化硫、含鉛化合物、苯并芘及固體顆粒物等[2]。據(jù)研究顯示，在英國，每年由汽車尾氣污染造成的死亡人數(shù)是車禍死亡人數(shù)的2倍以上[3]，汽車尾氣與心血管系統(tǒng)疾病，呼吸系統(tǒng)疾病，神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及生殖功能下降的相關性已得到越來越多的實驗證實。嚴超等[4]通過氣管滴注的方式將大鼠長期暴露于汽車尾氣來源的可吸入顆粒物中，發(fā)現(xiàn)汽車尾氣中的顆粒物可引起大鼠體重降低，肺臟及心臟組織結(jié)構受損，肝臟、脾臟及腎臟出現(xiàn)炎癥反應。楊偉等[5]利用構建汽車尾氣暴露裝置，發(fā)現(xiàn)汽車尾氣持續(xù)暴露可損傷雄性小鼠的生精組織及功能，且該作用與體內(nèi)氧化水平改變有關。張遵真等[6]發(fā)現(xiàn)汽油機尾氣可誘導A549細胞DNA氧化損傷，提示汽油機尾氣具有明顯的細胞毒性。雖然社會對汽車尾氣的危害高度重視，但目前對汽車尾氣致生物體損傷的研究報道較少，其原因主要是汽車尾氣成分復雜，缺乏較為可靠的尾氣染毒模型及評價指標，本課題組在構建汽車尾氣動物整體染毒裝置的基礎上，通過研究汽車尾氣暴露對小鼠運動力竭時間的影響，探討汽車尾氣對機體的損傷機制，以期為汽車尾氣致生物體損傷的醫(yī)學防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物及分組

SPF級昆明種小鼠24只，8～10周齡，體質(zhì)量20～25 g，雌雄各半，購自遼寧省實驗動物中心(合格證號：雄鼠211002300011604，雌鼠211002300011605)。將小鼠分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度55%～65%，晝夜交替，適應性飼養(yǎng)一周后，按隨機數(shù)字表法分為正常對照組，汽車尾氣短時間暴露(4 h·d-1)組和汽車尾氣長時間暴露(8 h·d-1)組，每組8只。

1.2 主要實驗儀器與試劑

玻璃染毒柜，主要由尾氣進氣口、排風口、空氣循環(huán)風扇、126型激光空氣質(zhì)量檢測儀(北京博朗通醫(yī)療科技有限公司)和?，擜R8100氧濃度監(jiān)測儀(香港?，斂萍加邢薰?組成。汽車尾氣來源于豐田牌小汽車(型號Previa，行使里程80 000 km，排量2.4 L)，使用92號乙醇無鉛汽油(中國石油公司大連分公司)。YLS-10B轉(zhuǎn)輪式疲勞儀(山東醫(yī)學科學院)，Antos2010酶標儀(鄭州安圖生物工程有限公司)，正置顯微鏡(日本Olympus公司)。還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒(美國BioLegend公司)。

1.3 汽車尾氣持續(xù)暴露條件的建立

將汽車怠速狀態(tài)下排出的氣體經(jīng)軟管通入染毒裝置內(nèi)(1.5 m ×1.5 m ×1.2 m )，根據(jù)預實驗測得的裝置內(nèi)空氣條件，每次通入尾氣180 s后關閉發(fā)動機，暫停30 min后再次通入汽車尾氣180 s。根據(jù)實驗分組，每日將小鼠分別暴露于汽車尾氣中 4 h和8 h，連續(xù)暴露30 d。在尾氣暴露過程中監(jiān)測裝置內(nèi)的O2濃度以及直徑小于等于1.0 μm的顆粒物(PM1.0)、直徑小于等于2.5 μm的顆粒物(PM2.5)和直徑小于等于10 μm的顆粒物(PM10)濃度。

1.4 運動力竭時間的測定

在實驗正式開始前，對小鼠進行轉(zhuǎn)輪奔跑適應性訓練，每次訓練30 min(轉(zhuǎn)輪條件設定：轉(zhuǎn)速15 r·min-1，電擊耐受時間5 s，刺激電流2 mA，難度系數(shù)按1～3逐漸增加)。連續(xù)訓練10 d后將小鼠放入轉(zhuǎn)輪式疲勞儀中進行運動力竭測試，測試條件為：轉(zhuǎn)速20 r·min-1，電擊耐受時間5 s，刺激電流2 mA，難度系數(shù)3；力竭狀態(tài)設置標準：休息時間30 s·次-1，10 min內(nèi)休息5次判定為力竭[7]。在汽車尾氣暴露結(jié)束后1 d，依照上述條件再次測定受試小鼠的運動力竭時間。

1.5 血液紅細胞參數(shù)和生化指標測定

在小鼠運動力竭測定結(jié)束后，立刻摘除眼球取血。由于小鼠血液量較少，采用血漿稀釋液稀釋100 μL血漿，用于紅細胞和血紅蛋白含量測定。另一份低速離心(1 000 g, 10 min)制備血清，用于谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量測定。

1.6 肺泡灌洗液的收集及分析

取血結(jié)束后脫頸處死小鼠，暴露頸部氣管，結(jié)扎氣管遠心端后剪開胸腔，暴露雙側(cè)肺臟，結(jié)扎一側(cè)肺支氣管，該側(cè)肺用于組織病理檢查取樣；未結(jié)扎的一側(cè)肺通過刺入主氣管的24 G留置針灌入0.5 mL預冷的生理鹽溶液，反復灌洗3～4次，收集支氣管-肺泡灌洗液(BALF)，1 200 g低溫離心20 min，留取上清液， 采用ELISA方法檢測上清中細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。用1 mL含有1% BSA的PBS重懸BALF中的細胞沉淀，取10 μL重懸液進行細胞計數(shù)。余液再次離心后棄上清，將細胞沉淀涂片后用瑞氏法染色并進行細胞分類計數(shù)。

1.7 肺臟組織病理學觀察

取未灌洗一側(cè)肺臟，用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋。包埋蠟塊用切片機制成4 μm組織切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學顯微鏡下觀察肺組織的病理改變。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果(Results)

2.1 汽車尾氣染毒模型的構建

在預實驗中，向染毒柜內(nèi)連續(xù)通入汽車尾氣6 min，可導致大部分小鼠死亡，死亡原因為一氧化碳中毒。將汽車尾氣通入時間設定為180 s，小鼠出現(xiàn)較為明顯的躁動，但再無死亡現(xiàn)象。故為了保證實驗連續(xù)性和有效性，將每次尾氣通入時間設定為180 s。在向裝置內(nèi)通入尾氣180 s時關閉汽車發(fā)動機，測定裝置內(nèi)可吸入顆粒物PM1.0、PM2.5和PM10的值，同時測定氧濃度，結(jié)果如表1所示。根據(jù)測定結(jié)果，將通入尾氣的時間間隔設置為30 min。

2.2 汽車尾氣暴露對小鼠運動力竭時間的影響

在汽車尾氣暴露前，首先檢測各組小鼠的運動力竭時間，結(jié)果無顯著差異。在連續(xù)30 d汽車尾氣暴露結(jié)束后第2天，再次檢測各組小鼠的運動力竭時間，結(jié)果如表2所示。與汽車尾氣暴露前相比，汽車尾氣可顯著降低小鼠的運動力竭時間，其中8 h·d-1組小鼠的運動力竭時間較4 h·d-1組明顯縮短(P<0.05)。與正常對照組相比，2個汽車尾氣暴露組的運動力竭時間明顯較短，其中8 h·d-1組小鼠的運動力竭時間最短。結(jié)果表明，汽車尾氣暴露可明顯影響小鼠的運動能力。

表1 汽車尾氣通氣結(jié)束后裝置內(nèi)PM和氧濃度值Table 1 The PM and oxygen concentration in the device after vehicle exhaust emission (± s, n=3)

注：PM是顆粒物，指空氣中的固體或液體顆粒狀物質(zhì)。

Note： PM stands for particulate matter, a small discrete mass of solid or liquid matter that remains individually dispersed in air.

2.3 汽車尾氣暴露對小鼠紅細胞數(shù)和血紅蛋白含量的影響

由表3可見，汽車尾氣長時間暴露可引起小鼠紅細胞數(shù)增高，其中8 h·d-1組血紅蛋白濃度較正常對照組明顯升高(P<0.05)；而4 h·d-1組小鼠紅細胞數(shù)和血紅蛋白濃度較正常對照組無明顯差異。

2.4 汽車尾氣暴露對小鼠血清中GSH，MDA和SOD的影響

與正常對照組相比，汽車尾氣暴露后小鼠血清中的抗氧化物質(zhì)GSH和SOD含量均有不同程度降低，其中8 h·d-1組血清中抗氧化物質(zhì)減少最為顯著(P<0.05)。汽車尾氣暴露可增加小鼠血清中脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的含量(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表2 汽車尾氣暴露對小鼠運動力竭時間的影響Table 2 Effect of vehicle exhaust exposure on the running exhausting time of mice (±s, n=8)

注：aP<0.05 vs. 正常對照組；bP<0.05 vs. 短時間暴露組；cP<0.05 vs. 暴露前。

Note：aP<0.05 vs. Control group;bP<0.05 vs. Short time exposure group;cP<0.05 vs. Before exposure.

表3 汽車尾氣暴露對小鼠紅細胞計數(shù)和血紅蛋白濃度的影響Table 3 Effect of vehicle exhaust exposure on RBC count and HGB of mice (±s, n=8)

注：aP<0.05 vs. 正常對照組；bP<0.05 vs. 短時間暴露組；RBC，紅細胞計數(shù)；HGB，血紅蛋白濃度。

Note：aP<0.05 vs. Control group;bP<0.05 vs. Short time exposure group; RBC, red blood cell; HGB, hemoglobin.

表4 汽車尾氣暴露對小鼠血清中GSH、SOD活性和MDA含量的影響Table 4 Effect of vehicle exhaust exposure on GSH, SOD activities and MDA content in the serum of mice (± s, n=8)

注：aP<0.05 vs. 正常對照組；bP<0.05 vs. 短時間暴露組。

Note：aP<0.05 vs. Control group;bP<0.05 vs. Short time exposure group.

2.5 汽車尾氣暴露對小鼠BALF中細胞因子濃度的影響

如表5所示，與正常對照組相比，汽車尾氣暴露組BALF中的炎癥性細胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α的含量均有不同程度升高，其中8 h·d-1組細胞因子濃度升高最為顯著(P<0.05)。

2.6 肺泡灌洗液中白細胞計數(shù)及分類比較

細胞涂片計數(shù)結(jié)果顯示，8 h·d-1組肺泡灌洗液中的白細胞計數(shù)較正常對照組和4 h·d-1組明顯升高(P<0.05)。其中，細胞涂片可見中性粒細胞百分比明顯升高(P<0.05)。

2.7 小鼠肺臟組織形態(tài)學變化

通過對肺組織切片HE染色后觀察可見，汽車尾氣暴露組肺泡間隔較正常對照組增厚，肺支氣管黏膜層中可見較多中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，管腔內(nèi)有較多含中性粒細胞的黏液。結(jié)果如圖1所示。

圖1 汽車尾氣暴露對小鼠肺組織結(jié)構的影響(HE, ×400)注：A，正常對照組；B，短時間暴露組；C，長時間暴露組；圖中標尺為100 μm。Fig. 1 The effect of vehicle exhaust exposure on the structure of mice lung tissue (HE, ×400)Note: A, Control group; B, Short time exposure group; C, Long time exposure group; the scale bars are 100 μm.

表5 汽車尾氣暴露對小鼠BALF中炎癥細胞因子水平的影響Table 5 Effect of vehicle exhaust exposure on inflammation cytokine in the BALF of mice (± s, n=8)

注：aP<0.05 vs. 正常對照組；bP<0.05 vs. 短時間暴露組。

Note：aP<0.05 vs. Control group;bP<0.05 vs. Short time exposure group.

表6 汽車尾氣對小鼠BALF中白細胞總數(shù)和中性粒細胞百分比的影響Table 6 Effect of vehicle exhaust exposure on the WBC and percentage of neutrophilic granulocyte

注：aP<0.05 vs. 正常對照組；bP<0.05 vs. 短時間暴露組；WBC，白細胞計數(shù)。

Note：aP<0.05 vs. Control group;bP<0.05 vs. Short time exposure group; WBC, White blood cell.

3 討論(Discussion)

隨著汽車工業(yè)水平的提高，汽車尾氣中有害物質(zhì)的排放已得到較好的控制，但由于汽車保有量的劇增和人們對健康重視程度的增加，汽車尾氣對健康的危害及其防治方法再次成為研究的熱點。流行病學及基礎研究結(jié)果均表明，長期暴露于汽車尾氣中可對機體造成不可逆性的系統(tǒng)性損傷，主要累及呼吸系統(tǒng)[8]、心血管系統(tǒng)[9]和神經(jīng)系統(tǒng)[10]。為進一步研究汽車尾氣對機體的損傷機制，進而探索防治方法，本課題組建立了汽車尾氣染毒裝置。目前常用的空氣污染物染毒實驗方法主要包括：經(jīng)氣管或者咽后壁滴注收集的空氣顆粒物[11]、將收集到的汽車尾氣顆粒物通過超聲波霧化的方法使動物吸入[8]、直接將動物暴露于污染物濃度較大的環(huán)境中[12]等方法，各種方法的實驗周期和效果差異較大。通過預實驗的探索和調(diào)整，本實驗中采用的汽車尾氣染毒裝置可以較為真實穩(wěn)定地模擬環(huán)境中的尾氣條件，為實驗的可重復性奠定了基礎。

運動能力是機體功能的綜合體現(xiàn)，運動力竭時間是反映動物運動能力的常用指標[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)，長時間暴露于汽車尾氣環(huán)境中，小鼠的運動力竭時間與暴露前和與正常對照組相比均明顯縮短，表明該汽車尾氣染毒模型可在較短時間內(nèi)對小鼠機能產(chǎn)生明顯影響。為進一步探究汽車尾氣暴露對小鼠機體的損傷機制，本研究對汽車尾氣暴露后小鼠紅細胞、肺臟和血清相關指標進行了檢測。

汽車尾氣成分復雜，主要包括多環(huán)芳烴、碳黑、氮氧化物、硝酸鹽、二氧化硫、硫酸鹽等。硫酸鹽、硝酸鹽和碳黑是構成PM2.5的主要成分，而PM2.5則是城市大氣污染物中的主要成分[14]。大氣中顆粒物直徑是決定顆粒物健康威脅程度的主要因素，直徑10 μm左右的顆粒物通常沉積在上呼吸道，2.5 μm以下的可深入到細支氣管和肺泡[15]。細顆粒物進入肺泡后，可直接影響肺的通氣功能，使機體處于缺氧狀態(tài)。本實驗發(fā)現(xiàn)，汽車尾氣長時間暴露組小鼠的紅細胞數(shù)和血紅蛋白含量較正常組明顯升高，可能與其持續(xù)處于慢性缺氧狀態(tài)有關。

本研究還顯示，汽車尾氣暴露組小鼠BALF中炎癥相關細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著高于正常對照組，此結(jié)果與陳軼等[16]研究汽車尾氣污染對小鼠血清炎癥因子影響的結(jié)果相一致，長期暴露于汽車尾氣環(huán)境中，可導致機體炎癥因子水平顯著升高，其機制可能與氣態(tài)污染物損傷呼吸道黏膜上皮細胞[17]，以及PM2.5上黏附的過渡金屬刺激有關[15]。細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α均參與中性粒細胞的激活和黏附[18]，在對BALF中細胞分析后發(fā)現(xiàn)，汽車尾氣長時間暴露組BALF中的白細胞數(shù)以及中性粒細胞百分比較正常對照組明顯升高，中性粒細胞由骨髓造血干細胞分化而來，在正常情況下，中性粒細胞主要存在于外周血中，當局部有病原體入侵時，中性粒細胞就會被招募到入侵部位殺傷病原體[19]。BALF中性粒細胞比例升高可能與汽車尾氣造成呼吸道黏膜上皮細胞損傷進而引起病原菌入侵有關。同時，我們觀察到8 h·d-1組小鼠肺臟組織結(jié)構發(fā)生了一定的病理改變，包括肺泡壁變厚，中性粒細胞及淋巴細胞浸潤支氣管黏膜層等，表明長時間的汽車尾氣暴露可對肺臟組織結(jié)構產(chǎn)生損傷，小鼠運動力竭時間減少可能與其肺臟損傷有關。但我們也觀察到：雖然4 h·d-1組小鼠運動力竭時間較正常組明顯縮短，小鼠肺內(nèi)的炎癥水平與正常對照組相比并無明顯差異，肺臟組織結(jié)構也無明顯病理改變，表明汽車尾氣造成的肺損傷不是影響小鼠運動能力的唯一因素。

機體持續(xù)處于氧化應激狀態(tài)是大氣顆粒物對機體造成損傷的機制之一，大氣中的顆粒物通過肺進入機體后，可通過氧化應激產(chǎn)生大量的自由基對組織造成損傷，其中附著在顆粒物上的過渡金屬在組織局部釋放濃度較高的金屬離子是自由基產(chǎn)生的主要因素[20]；長時間運動后機體也可產(chǎn)生大量自由基，具體機制是長時間運動導致機體能量需求量增加，組織細胞有氧代謝率顯著提高，需要紅細胞提供大量氧分子，紅細胞氧運輸速率的增加導致氧自由基的產(chǎn)生幾率顯著增加[21]，氧自由基與細胞膜上的多不飽和脂肪酸反應可形成具有細胞毒性的脂質(zhì)過氧化物，MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇細胞膜的損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)，汽車尾氣暴露組小鼠血清中的MDA含量與正常對照組小鼠相比明顯增加。分析原因可能是由于汽車尾氣暴露導致體內(nèi)氧自由基積累增多，隨后的力竭運動導致體內(nèi)的氧自由基產(chǎn)生量進一步增加，機體抗氧化能力由于之前尾氣連續(xù)作用已不足以對抗新增加的氧自由基，從而導致小鼠體內(nèi)氧化與抗氧化平衡被打破，運動能力顯著下降。SOD和GSH是機體重要的抗氧化物質(zhì)，在清除氧自由基中起關鍵作用，本實驗發(fā)現(xiàn)汽車尾氣暴露組小鼠體內(nèi)的SOD和GSH量較正常對照組均明顯減少，提示可能與氧自由基持續(xù)增多，進而導致抗氧化物質(zhì)過量消耗有關。綜上所述，汽車尾氣可通過損傷肺臟功能和增加機體氧化應激壓力對小鼠的運動功能產(chǎn)生影響。本研究中使用的汽車尾氣染毒裝置和染毒方法，為進一步深入研究創(chuàng)造了條件，利用小鼠運動力竭時間判斷整體機能狀況可作為實驗性汽車尾氣致機體損傷的評價指標。

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