梁慧玲+何曉琴+甘園園

[摘要] 目的 研究放療后SHIP2在喉癌Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)情況及與Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期之間的對應(yīng)關(guān)系。 方法 取對數(shù)生長期的喉癌Hep-2細(xì)胞，分為實驗組（2、4、8 Gy X線）與對照組（0 Gy X線）兩組，各組給予不同劑量X線處理后12、24、36、48 h，運用CCK-8檢測Hep-2細(xì)胞增殖活力。根據(jù)細(xì)胞活力檢測結(jié)果，確定射線處理后最適宜的時間點作為后續(xù)實驗檢測的具體時間點。實驗組與對照組給予對應(yīng)處理后特定時間，運用Annexin V-FITC/PI雙染流氏細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，RT-qPCR檢測SHIP2 mRNA相對表達(dá)量，Western-blot檢測SHIP2蛋白的相對表達(dá)量。 結(jié)果 與對照組比較，實驗組Hep-2細(xì)胞活性降低（P < 0.05），且隨放射劑量遞增，細(xì)胞增殖活力降低，處理后48 h檢測結(jié)果最為顯著。實驗組各組Hep-2細(xì)胞凋亡數(shù)較對照組均明顯增加（均P < 0.01）。實驗組中給予4 Gy、8 Gy X線照射處理的Hep-2細(xì)胞G2/M期阻滯與對照組相比顯著增加（均P < 0.01）。實驗組Hep-2細(xì)胞中SHIP2的mRNA及蛋白相對表達(dá)量較對照組均有所降低（均P < 0.01）。 結(jié)論 放射線處理后SHIP2的下調(diào)表達(dá)可能是X線抑制Hep-2細(xì)胞增殖、促進(jìn)其細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯的重要途徑。

[關(guān)鍵詞] X線；SHIP2；增殖；凋亡；細(xì)胞周期

[中圖分類號] R739.65 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（c）-0004-06

[Abstract] Objective To explore the relation between the expression of SHIP2 and proliferation， apoptosis and cell cycle in Hep-2 cells after radiotherapy. Methods Lupine carcinoma Hep-2 cells were divided into the experiment group （treated with 2， 4， 8 Gy X- ray） and the control group （treated with 0 Gy）. CCK-8 was repeatedly used to detect the proliferation of the cells 12， 24， 36 h and 48 h after the treatment. The most appropriate and exact time to detect cells in the subsequent experiment was set up following the result of proliferation. Then apoptosis was evaluated by AnnexinV- FITC/PI double staining flow cytometry and cell cycle was evaluated by PI single staining flow cytometry. RT-qPCR and Western-blot were used to detect the expression of SHIP2 mRNA and its protein. Results Compared with the control group， Hep-2 cells' proliferation in the experiment group was inhibited （all P < 0.05） . As the dose of ray increased， the viability descended， and the most remarkable result arose 48 h after the treatment. There was a remarkable increase in apoptosis of the experiment group （all P < 0.01）. After treated with 4 Gy and 8 Gy X-ray G2/M phase arrest was remarkable too （all P < 0.01）. The expression of SHIP2 mRNA and SHIP2 protein in the experiment group was lower than those of the control group （all P < 0.01）. Conclusion In Hep-2 cells， low expression of SHIP2 after the treatment with X-ray， may be one important pathway of X-ray inhibiting cell proliferation and increasing cell apoptosis and G2/M phase arrest.

[Key words] X-ray； SHIP2； Proliferation； Apoptosis； Cell cycle

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其最常見的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌[1-2]。手術(shù)和放射治療是喉癌的主流治療方式，在保留喉部功能從而保證治療后生活質(zhì)量方面放療明顯優(yōu)于手術(shù)治療，但由于喉癌細(xì)胞內(nèi)在的放射敏感性不同，甚至部分喉癌細(xì)胞出現(xiàn)輻射耐受的情況，使得部分患者的放射治療效果并不理想[3]。為了探明喉癌細(xì)胞的輻射耐受機制，人們做了各種各樣的嘗試。有研究發(fā)現(xiàn)，放射后腫瘤細(xì)胞的某些基因表型發(fā)生改變，并且認(rèn)為這種改變與腫瘤細(xì)胞的輻射耐受存在相關(guān)性[4-5]。含SH2域的多磷酸肌醇-5-磷酸酶Ⅱ（the SH2 domain containing inositol polyphosphate 5-phosphatase-2，SHIP2）作為一種重要的多磷酸肌醇-5-磷酸酶，在多種惡性腫瘤中表達(dá)下降，成為各類型腫瘤研究的熱點[6]，Ye等[7]提出SHIP2在胃癌中的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而提高了胃癌細(xì)胞的PI3K/Akt信號通路的活性、促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和生長，Bao等[8]提出，PI3K/Akt信號通路活性的增強可能使喉癌細(xì)胞產(chǎn)生輻射耐受。因此，本研究認(rèn)為SHIP2可能參與喉癌細(xì)胞的增殖與生長，并可能與喉癌的輻射耐受存在相關(guān)性。endprint

鑒于以上原因，本研究設(shè)計了以下實驗：研究分析人鱗狀細(xì)胞癌株Hep-2細(xì)胞X線照射后細(xì)胞增殖、凋亡和周期的變化以及細(xì)胞中SHIP2的表達(dá)情況，從而證實SHIP2是否與喉癌細(xì)胞的增殖、生長有關(guān)，為臨床上研究喉癌患者放射敏感性的個體化及預(yù)測其預(yù)后提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件

人鱗狀細(xì)胞癌株Hep-2細(xì)胞購于武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心。細(xì)胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 DEME高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液、PBS緩沖液購自GIBCO公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；羊抗SHIP2抗體購自Santa Cruz公司；小鼠抗β-actin抗體、辣根過氧化物（HRP）標(biāo)記的兔抗羊抗體購自武漢博士德生物公司；RNA提取試劑TRIzol及二甲基亞砜（DMSO）購自Invitrogen公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒、細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒CCK-8均購自江蘇碧云天公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC/PI apoptosis kit及細(xì)胞周期染色試劑盒cell cycle stain kit均購自杭州聯(lián)科科技有限公司；十二烷基磺酸鈉聚丙酰胺（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物均購自ASPEN公司。

1.2.2 主要儀器 倒置顯微鏡：BX51，日本Olympus公司；超凈工作臺：AIRTECH公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱：CB150，德國Binder公司；酶標(biāo)儀：美國PerkinElmer公司；熒光定量PCR儀：7500，美國ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)：Geliance 200，美國PerkinElmer公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流蛋白電泳儀：MINI，美國BIO-RAD公司；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)：LI-COR Odyssey公司；流式細(xì)胞儀：美國BD公司；紫外分光光度計：UV762，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3照射條件

指數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞，6 MV X線0、2、4、8 Gy照射，射野30 cm×40 cm，SSD = 100 cm，培養(yǎng)瓶上覆蓋0.5 cm有機玻璃板，照射設(shè)備為武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心放射治療設(shè)備。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力

將對數(shù)生長期人鱗狀細(xì)胞癌株Hep-2細(xì)胞鋪于4塊96孔培養(yǎng)板中，實驗分為2組：實驗組（2、4、8 Gy X線）和對照組（0 Gy X線），過夜貼壁后分別給予不同劑量X線照射。于照射后12、24、36、48 h每孔加入10 μL增強型CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h后用酶標(biāo)儀在450 nm處測定其吸光度OD值。細(xì)胞增殖活力由細(xì)胞存活率反映。細(xì)胞存活率=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%（As：即試驗孔，含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、增強型CCK-8溶液，經(jīng)放射線處理；Ac：即對照孔，含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、增強型CCK-8溶液，未經(jīng)放射線處理；Ab：即空白孔（空白組），不含細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8，未經(jīng)放射線處理）。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期

同1.4法分組后細(xì)胞在培養(yǎng)箱內(nèi)過夜貼壁，待6孔板內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)70%左右時，實驗組和對照組分別給予不同劑量X線照射，照射后2 h內(nèi)換液后繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后依照試劑盒說明書步驟收集細(xì)胞并加入染料，于1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀測試，記錄并分析各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期。

1.6 RT-qPCR檢測SHIP2 mRNA的相對表達(dá)量

細(xì)胞處理同前。設(shè)計引物，β-action：上游5′-GT？鄄CCACCGCAAATGCTTCTA-3′，下游5′-TGCTGTCACC？鄄TTCACCGTTC-3′；SHIP2：上游5′-TGTGGAAATCCTA？鄄CCCTG AAACT-3′，下游5′-GTAACTC CA ACCTCA？鄄AATGTCCC-3′。PCR反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，最終數(shù)據(jù)運用相對定量分析法進(jìn)行分析。

1.7 Western-blot檢測SHIP2蛋白的相對表達(dá)量

細(xì)胞處理同前。按總蛋白提取試劑盒上操作說明提取Hep-2細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將40 μg蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液中，沸水浴10 min至蛋白變性。用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用10%脫脂牛奶常溫封閉1 h，接著加入一抗置于搖床上4℃過夜孵育，漂洗后加入二抗室溫下孵育1 h，再次漂洗。顯影后應(yīng)用圖像分析軟件進(jìn)行吸光度分析，最后計算蛋白的相對表達(dá)量（目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白吸光度/內(nèi)參的吸光度）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hep-2細(xì)胞增殖活力檢測結(jié)果

各組細(xì)胞分別給予不同劑量X線照射處理后12、24、36、48 h用CCK-8法檢測不同時間點各組樣本OD值。見表1。分析計算不同劑量射線處理后不同時間點的細(xì)胞增殖活力即細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，與0 Gy組比較，放射處理后各組Hep-2細(xì)胞活性均降低（均P < 0.05），且隨著放射劑量遞增，細(xì)胞增殖活力降低，48 h時最明顯（故后續(xù)實驗均選擇于處理后48 h時間點進(jìn)行相關(guān)檢測）。見圖1。

2.2 Hep-2細(xì)胞凋亡情況

應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染經(jīng)不同劑量X線處理后48 h的Hep-2細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析得到細(xì)胞散點圖。見圖2。0 Gy組細(xì)胞凋亡率：（7.04±0.11）%；2 Gy組細(xì)胞凋亡率：（9.49±0.26）%；4 Gy組細(xì)胞凋亡率：（13.72±0.61）%；8 Gy組細(xì)胞凋亡率：（23.61±0.57）%。與0 Gy比較，放射處理后Hep-2細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，且隨劑量增長效果明顯（均P < 0.01）。endprint

2.3 Hep-2細(xì)胞周期變化

應(yīng)用PI單染不同劑量X線處理后48 h的Hep-2細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析得到二維直方圖。見圖3。分析不同劑量射線處理后48 h Hep-2細(xì)胞各細(xì)胞周期所占比例。見表2。與0 Gy組比較，給予4、8 Gy X線照射處理的Hep-2細(xì)胞G2/M期所占比例與0 Gy組相比顯著增加（均P < 0.05），G1期和S期所占比例與0 Gy組相比降低（均P < 0.05）；給予2 Gy X線照射處理組各細(xì)胞周期無明顯變化（P > 0.05）。

2.4 SHIP2的表達(dá)情況

應(yīng)用RT-qPCR檢測經(jīng)不同劑量X線處理后48 h Hep-2細(xì)胞中SHIP2 mRNA的相對表達(dá)量，與0 Gy組比較，SHIP2 mRNA表達(dá)量水平顯著下調(diào)（均P < 0.01）。見圖4。應(yīng)用Western-blot檢測不同劑量X線處理后48 h喉癌Hep-2細(xì)胞中SHIP2蛋白的相對表達(dá)量，與0 Gy組比較，SHIP2蛋白表達(dá)量水平顯著下調(diào)（均P < 0.01）。見圖5。

3 討論

喉癌為口腔咽喉部發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其絕大部分病理類型為鱗狀細(xì)胞癌[2]。目前國際公認(rèn)的主要治療手段為手術(shù)治療、放療和化療。對于早期喉癌，放療與根治手術(shù)治療的效果相當(dāng)，且能為患者保留完整的發(fā)音及吞咽功能[3]。部分患者于放療過程中出現(xiàn)放射耐受現(xiàn)象，使得腫瘤的治療效果不佳甚至進(jìn)展和復(fù)發(fā)，放療耐受已成為喉癌治療的瓶頸。

腫瘤的放射治療主要是通過電離輻射在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量高反應(yīng)、不穩(wěn)定的自由基，間接作用于生物大分子，導(dǎo)致機體內(nèi)以DNA為主的各種生物大分子結(jié)構(gòu)改變、活性降低或喪失，最終引起被照射細(xì)胞的凋亡、周期阻滯、突變等后果[9-10]。已有不少研究證實，放射治療后DNA損傷修復(fù)是導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生獲得性放療耐受的重要機制，并且隨著研究的不斷深入，人們意識到細(xì)胞的氧合狀態(tài)、細(xì)胞周期、增殖活性等也與獲得性放療耐受密切相關(guān)，其本質(zhì)是與輻射生物效應(yīng)相關(guān)的各種基因編譯、基因多態(tài)性及表觀修飾造成放射敏感性的差異[4，11-13]。Aypar等[4]指出，接受放射后的和未接受放射的同一細(xì)胞系基因表型發(fā)生了改變，并猜測輻射所介導(dǎo)的基因不穩(wěn)定性與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Kim等[5]實驗表明，在人喉癌Hep-2細(xì)胞中，放療耐受株與普通喉癌Hep-2細(xì)胞相比，有多種放射敏感基因表型發(fā)生變化。因此要詮釋并解決喉癌的放療耐受問題，亟需尋找出與喉癌放療耐受相關(guān)的基因，為放療增敏和逆轉(zhuǎn)放療耐受尋找新靶點。

SHIP2是一種重要的肌醇磷酸酶，它通過其5'磷酸酶活性，選擇性地水解磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸[PI（3，4，5）P3] 5′位點上磷酸生成磷脂酰肌醇3，4二磷酸[PI（3，4）P2]，而PIP2由PI3K催化合成PIP3[14]。PIP3作為重要的第二信使，調(diào)控著許多細(xì)胞活動，如細(xì)胞的生長、繁殖、凋亡、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞的趨藥性以及神經(jīng)元的發(fā)育和功能。總的說來，SHIP2可通過對PIP3的調(diào)節(jié)而與腫瘤、炎癥、心血管疾病以及糖尿病等疾病相關(guān)聯(lián)[15-16]。鄒力等[17]提出SHIP2通過抑制PI3K/Akt信號傳導(dǎo)對胰島素敏感性進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。Elong等[18]發(fā)現(xiàn)，SHIP2調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附途徑，并正向調(diào)控細(xì)胞的運動。

近年來，不斷有關(guān)于SHIP2與各種腫瘤之間的研究、猜想及分析，但在不同類別的腫瘤中發(fā)揮的作用不同，甚至表現(xiàn)出正性調(diào)控及負(fù)性調(diào)控兩種截然不同的作用：在乳腺癌、肝細(xì)胞肝癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌以及預(yù)后不良的患者中SHIP2均過度表達(dá)，而在胃癌中SHIP2的表達(dá)是下降的[6]。Fu等[19-20]的多個實驗比較了SHIP2在人肝細(xì)胞肝癌、非小細(xì)胞肺癌以及結(jié)直腸癌組織與其對應(yīng)的癌旁組織的表達(dá)情況，結(jié)果均顯示出明顯的差異。Ye等[7]提出SHIP2在胃癌中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而提高了胃癌細(xì)胞的PI3K/Akt信號通路的活性、促進(jìn)了細(xì)胞增殖及腫瘤形成。Zhou等[21]比較喉鱗癌組織與癌旁組織中SHIP2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，SHIP2蛋白在喉癌中的表達(dá)明顯升高，且其表達(dá)與喉鱗癌T分級、臨床分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)相關(guān)。故本研究認(rèn)為SHIP2與喉癌的放療耐受相關(guān)，于是設(shè)計本實驗對SHIP2的表達(dá)與放射后喉癌細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞周期的關(guān)系進(jìn)行初步探究。

本實驗首先對X線處理后喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的變化進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，X線照射后Hep-2細(xì)胞的增殖活力降低，細(xì)胞凋亡率增加、G2/M期阻滯增加，此結(jié)果可以由X線引起的DNA等生物大分子結(jié)構(gòu)及功能的改變，進(jìn)而引起細(xì)胞的凋亡、周期阻滯解釋。給予2 Gy X線照射處理的Hep-2細(xì)胞G2/M期阻滯與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能為輻射劑量較低對細(xì)胞造成的影響較小的原因。為了進(jìn)一步探索輻射介導(dǎo)的SHIP2基因表型的改變或者基因表達(dá)水平的改變與喉癌放療耐受的關(guān)系，本研究對經(jīng)不同劑量X線照射處理后48 h的Hep-2細(xì)胞中SHIP2 mRNA及蛋白相對表達(dá)量進(jìn)行了分組比較，結(jié)果提示，照射后Hep-2細(xì)胞中SHIP2 mRNA及蛋白相對表達(dá)量較照射前明顯降低。由此筆者考慮輻射介導(dǎo)的SHIP2的下調(diào)表達(dá)可能是X線抑制Hep-2細(xì)胞增殖、促進(jìn)其細(xì)胞凋亡、G2期阻滯的重要途徑。但是SHIP2在喉癌中是否也是通過PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路作用于細(xì)胞，并產(chǎn)生什么樣的調(diào)節(jié)，又是否與喉癌的放療耐受相關(guān)，今后計劃進(jìn)一步建立喉癌放療耐受株后在上述信號通路各個水平上進(jìn)行相關(guān)性驗證。

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（收稿日期：2017-09-20 本文編輯：王 娟）endprint