趙起超，方佳寧，馬冠英，張晨昀，呂旦希，張若男，高夢煒，陳功星

（杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

影響細(xì)胞生長存活的因素很多，營養(yǎng)、pH值、溫度是最基本的條件。細(xì)胞生長是一個(gè)持續(xù)的過程，而實(shí)驗(yàn)研究存在時(shí)間間隔。目前維持細(xì)胞生長常見的處理方法是每隔1天行換液傳代[1]或者凍存。最近，細(xì)胞自噬引起關(guān)注。自噬是一種保守的細(xì)胞防御機(jī)制，在一定條件下細(xì)胞自噬能夠維持細(xì)胞的存活[2]。引起細(xì)胞自噬的因素很多，包括血清、葡萄糖、溫度和二氧化碳等。本文將探討室溫中維持Jurkat細(xì)胞非實(shí)驗(yàn)期的培養(yǎng)，并從細(xì)胞自噬方面尋求依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 白血病T淋巴細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞為培養(yǎng)細(xì)胞，小牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基 （含青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL）、MTT購于Sigma公司；無菌塑料培養(yǎng)瓶為上海BD Falcon產(chǎn)品；封口膜為美國Parafilm公司產(chǎn)品。兔抗人LC3和Anti-rabbit IgG（H+L）（DyLight 800） 購于 Cell signaling 公司、βactin兔抗人多克隆抗體購于杭州華安生物公司；Western blot凝膠電泳試劑購于武漢谷歌生物技術(shù)公司；PVDF膜為Millipore公司產(chǎn)品；蛋白提取試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞株Jurkat培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，半量換液傳代，加入相近量的細(xì)胞培養(yǎng)劑，置于37℃培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞呈對數(shù)生長時(shí)備用。

1.2.2溫度對細(xì)胞生長的影響 Jurkat細(xì)胞2×105/mL接種6瓶，37℃培養(yǎng)箱放置1天，一分為二，分別于培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)和封口后室溫培養(yǎng)，1天后各取1瓶，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板100μL/孔接種8孔，各2塊，其余細(xì)胞回收；其中1塊細(xì)胞孔加入10μL 5%的 MTT，混勻后置于 37℃培養(yǎng)箱中，4小時(shí)后1000rpm離心5分鐘，然后加入100μL DMSO，振蕩混勻溶解，570nm檢測光密度OD值。另一塊96孔板細(xì)胞加入100μL新鮮培養(yǎng)劑，37℃培養(yǎng)箱放置1天后加入20μL 5%的MTT，混勻后按前述一樣操作檢測光密度OD值。此后的細(xì)胞每隔2天重復(fù)上述操作。

1.2.3蛋白樣品制備與western blot分析 按照蛋白提取試劑盒，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入相應(yīng)的提取試劑，依次制備蛋白電泳樣品，然后上樣到12%分離膠的垂直電泳變性膠上，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，根據(jù)marker位置裁剪actin膜和LC3膜，分別進(jìn)入相應(yīng)抗體4℃搖床過夜，然后TBST洗滌后一同進(jìn)入Anti-rabbit IgG（H+L）（DyLight 800）反應(yīng)液中作用2小時(shí)，洗滌后用Odyssey雙紅外熒光掃描儀保存圖片觀察結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 細(xì)胞活力以光密度OD值用（±s）表示，用SPSS軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本均值t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞活力MTT檢測吸光度OD值 Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)于37℃培養(yǎng)箱中，1天后換液傳代，此時(shí)細(xì)胞呈對數(shù)生長，細(xì)胞活力達(dá)到最強(qiáng)，4天后細(xì)胞活力明顯下降，6天后繼續(xù)下降，各時(shí)間點(diǎn)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而室溫培養(yǎng) 2天與4天細(xì)胞活力處于較高的位置，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但6天細(xì)胞活力明顯下降，與4天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖 1）。 此外，對上述室溫培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)同樣細(xì)胞數(shù)量等倍新鮮培養(yǎng)劑傳代培養(yǎng)，在37℃培養(yǎng)箱1天后，細(xì)胞活力均明顯升高，OD值接近被傳代細(xì)胞的2倍，結(jié)果顯示，2天和4天傳代培養(yǎng)后兩組細(xì)胞的增值MTT值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與6天傳代培養(yǎng)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖 2）。

2.2細(xì)胞自噬LC3蛋白分子表達(dá)Western blot檢測 Odyssey雙紅外熒光掃描儀同時(shí)分析了actin和LC3蛋白分子的表達(dá)，以actin為參照，呈現(xiàn)樣本量接近，LC3均出現(xiàn)了16 KD和14 KD兩條帶，在相同溫度內(nèi)的不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)（2天和4天）之間未見差異，但在相同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的不同培養(yǎng)溫度（37℃和室溫）之間存在明顯差異，室溫培養(yǎng)細(xì)胞均出現(xiàn)了14 KD的量度增加，在圖中體現(xiàn)寬度更大，而16 KD相對37℃培養(yǎng)細(xì)胞量度減少，可見條帶要細(xì)小一些（圖3）。

圖1 Jurkat細(xì)胞在兩種溫度培養(yǎng)條件下的MTT檢測吸光度OD值

圖2 Jurkat細(xì)胞在室溫培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)1天后MTT檢測吸光度OD值

圖3 不同溫度培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞Western blot檢測結(jié)果

3 討論

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛使用的實(shí)驗(yàn)手段。細(xì)胞是不斷生長、脆弱的簡單生命體，需要時(shí)刻關(guān)注、維護(hù)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。細(xì)胞凍存可以在保存細(xì)胞生命的同時(shí)，暫時(shí)阻斷生長，但凍存后細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)間較長；為滿足實(shí)驗(yàn)條件需要保持細(xì)胞呈指數(shù)生長，這就增加了遺傳穩(wěn)定性問題，非實(shí)驗(yàn)期無意義的傳代會(huì)導(dǎo)致子代細(xì)胞很快達(dá)到較大傳代次數(shù)，其細(xì)胞特性、對藥物的反應(yīng)、病原體易感性、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)可發(fā)生變化，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度[3]。前期實(shí)驗(yàn)利用低溫延緩Jurkat細(xì)胞傳代次數(shù)，20天內(nèi)不傳代細(xì)胞存活率仍然維持80%以上[4]，但該技術(shù)傾向于細(xì)胞保存，隨后恢復(fù)細(xì)胞對數(shù)期生長耗時(shí)較長。本實(shí)驗(yàn)中室溫培養(yǎng)條件下Jurkat細(xì)胞4天時(shí)的細(xì)胞活力仍與2天時(shí)相擬（P＞0.05），至 6 天時(shí)出現(xiàn)明顯的差異（P＜0.01），此結(jié)果與本研究前期用臺盼蘭分析Jurkat細(xì)胞存活的研究報(bào)道[4]一致。而37℃培養(yǎng)4天時(shí)細(xì)胞活力已明顯不如2天（P＜0.01），表明Jurkat細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱環(huán)境中不能維持4天以上，須進(jìn)行換液或傳代處理。本實(shí)驗(yàn)中Jurkat細(xì)胞室溫培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞前期處理同文獻(xiàn)報(bào)道[5]，培養(yǎng)過夜后封口，細(xì)胞仍然保持了一定的活力，這與報(bào)道文獻(xiàn)[5]相一致。而本研究室溫各培養(yǎng)點(diǎn)傳代37℃培養(yǎng)1天后，細(xì)胞活力均達(dá)到了傳代前的2倍左右，且室溫2天與4天傳代37℃培養(yǎng)后細(xì)胞活力未見差異（P＞0.05），表現(xiàn)出了細(xì)胞對數(shù)期生長的特點(diǎn)。因此，Jurkat細(xì)胞室溫培養(yǎng)4天后再行傳代室溫培養(yǎng)，可替代37℃培養(yǎng)，說明Jurkat細(xì)胞傳代時(shí)間延長了一倍。對這兩種溫度條件下的細(xì)胞再行細(xì)胞自噬分析，觀察細(xì)胞2天和4天后，發(fā)現(xiàn)室溫培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞自噬增強(qiáng)，相關(guān)研究表明，細(xì)胞經(jīng)亞低溫處理后，恢復(fù)到正常體溫，細(xì)胞發(fā)生了自噬、凋亡、氧化損傷等一系列變化[6]，這也表明了低溫誘導(dǎo)細(xì)胞自噬在一定程度上具有細(xì)胞保護(hù)作用[2]。亞低溫在臨床上已經(jīng)運(yùn)用于對重要器官缺血缺氧的保護(hù)，重型創(chuàng)傷性顱腦損傷采用亞低溫腦保護(hù)治療，可有效降低患者顱內(nèi)壓，減少出血量[7]。通過本研究表明室溫條件下4天內(nèi)可以維持非實(shí)驗(yàn)期細(xì)胞正常培養(yǎng)，減少無意義的細(xì)胞傳代導(dǎo)致的人力物力浪費(fèi)和細(xì)胞生物遺傳穩(wěn)定性的問題。

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