李衛(wèi)玲，易初麗

（江漢大學(xué) 武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北 武漢 430056）

質(zhì)粒是染色體外能夠自我復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，以超螺旋狀態(tài)存在，幾乎完全裸露，主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒DNA廣泛應(yīng)用于基因工程、生物醫(yī)學(xué)的研究以及生物產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用。質(zhì)粒DNA純化是其應(yīng)用的關(guān)鍵步驟，直接影響到轉(zhuǎn)化、測序、PCR、酶切和轉(zhuǎn)染等下游實驗。一般質(zhì)粒DNA約為2～20 kb，初步純化的質(zhì)粒DNA構(gòu)型分為超螺旋、開口環(huán)狀及線性3種，其中超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化和表達效率最高。質(zhì)粒DNA安全性好、毒性低和免疫原性較低、便于分離和提取，在DNA重組技術(shù)、轉(zhuǎn)基因方面有廣泛應(yīng)用。

1 質(zhì)粒DNA常用純化方法

質(zhì)粒DNA分離純化的方法大致可分為兩類：一是傳統(tǒng)萃取抽提的液相法，如煮沸法、苯酚氯仿法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法等；二是固體介質(zhì)法，如硅膠膜法、陰離子交換膜法及磁珠法等。后者操作步驟簡便，提取純度較好。

1.1 硅膠為基礎(chǔ)的提取方法

硅膠可以吸附核酸，DNA分子與硅膠表面的相互作用主要包括靜電作用、疏水作用、氫鍵作用等［1］。硅膠或二氧化硅為基礎(chǔ)的方法是最常用的提取方法，常應(yīng)用微孔玻璃、嵌入二氧化硅顆粒的濾膜、硅膠顆粒、二氧化硅構(gòu)成的藻土型樹脂和玻璃纖維［2］。在高濃度的離液鹽，如鹽酸胍和異硫氰酸胍等條件下，帶負(fù)電荷的DNA和帶正電荷的二氧化硅粒子有很高的親和力，可用低離子強度的緩沖液或蒸餾水洗脫DNA。目前實驗室多用帶有硅基質(zhì)膜的離心柱試劑盒操作。

1.2 磁基質(zhì)為基礎(chǔ)的提取方法

磁珠法是利用表面經(jīng)過硅羥基修鈽的復(fù)合磁性納米微球提取核酸［3］，已在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。用于核酸純化的磁性微粒有 Fe3O4/SiO2、Fe3O4/SiO2/TiO2等［4］。根據(jù)表面修飾基團可分為羥基［5］、羧基［6］、氨基［7］納米磁珠和多聚乙烯亞胺［8］磁珠。磁珠法可同時處理多個樣品，易實現(xiàn)自動化操作，特別適用于微量樣本的DNA提取。

1.3 陰離子交換為基礎(chǔ)的提取方法

陰離子交換膜也常用于分離核酸?；贒NA主鏈上的帶負(fù)電荷的磷酸根離子與分子表面上帶正電的DEAE等基團之間相互作用，在低pH值及低鹽濃度下DNA可與陰離子交換劑結(jié)合，可用高pH值及高濃度的鹽溶液來洗脫DNA。洗脫的核酸通常需要乙醇或異丙醇沉淀去除鹽。陰離子交換柱得到的核酸純度很高［9］，其缺點是操作繁瑣，不適合日常實驗要求，常與色譜技術(shù)結(jié)合，用于超螺旋構(gòu)型和無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA純化。

2 質(zhì)粒DNA純化中內(nèi)毒素去除

常規(guī)質(zhì)粒DNA純化中，質(zhì)粒DNA仍需要從55%蛋白質(zhì)、20%RNA、3%內(nèi)毒素和3%基因組DNA中分離［10-11］。其中內(nèi)毒素又稱脂多糖，是革蘭陰性菌細(xì)胞外膜的主要成分［12］。脂多糖由疏水的脂質(zhì)A部分、核心寡糖和雜多糖鏈及菌株特異性O(shè)抗原組成，其中脂質(zhì)A是主要活性位點［13］。在質(zhì)粒DNA制備的菌體裂解過程中，內(nèi)毒素分子被釋放到溶菌液中。由于內(nèi)毒素常形成囊狀結(jié)構(gòu)，其分子量、電荷性和疏水性都與質(zhì)粒DNA相似，常用的純化方法很難將內(nèi)毒素與質(zhì)粒DNA分開。內(nèi)毒素會降低原代細(xì)胞和敏感培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，干擾免疫細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染。內(nèi)毒素還會導(dǎo)致機體發(fā)熱、低血壓、呼吸窘迫、血管內(nèi)凝血及內(nèi)毒素性休克綜合癥，內(nèi)毒素可通過激活TLR4刺激炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10及TNF-α的合成。國家藥監(jiān)局規(guī)定，DNA疫苗制品中內(nèi)毒素含量不得高于0.01 EU/μg，個人用劑量不超過20 EU。

內(nèi)毒素去除策略有兩種：一是在質(zhì)粒DNA結(jié)合階段去除；二是質(zhì)粒DNA洗脫后去除。目前內(nèi)毒素的去除方法主要包括非選擇性去除，如吸附［14］、超濾［15］和排阻色譜法［16］；選擇性沉淀，如采用多粘菌素 B［17］、組胺酸類［18］、聚-L-賴氨酸［19］親和層析；此外，還有疏水作用色譜法［20］和離子交換色譜法［21］。以下介紹幾種去除內(nèi)毒素的方法。

2.1 親和層析法

多粘菌素B（polymyxin-B，PMX-B）是一種環(huán)狀親脂性抗生素，有10個氨基酸的多肽，其中7個氨基酸形成環(huán)狀化合物，在N-端連接一個脂肪鏈。一般認(rèn)為多粘菌素B是通過本身的陽離子與內(nèi)毒素活性部位磷脂A的陰離子相結(jié)合［22］，其作用還包括靜電作用、離子作用、親水作用和其他分子之間的相互作用［23］。以PMX-B為配基制成纖維素親和膜介質(zhì)，目前主要用于臨床血液透析，還可用于內(nèi)毒素含量檢測［24］。

環(huán)糊精是環(huán)狀聚糖，呈管狀結(jié)構(gòu)。γ環(huán)糊精含8個單糖，內(nèi)徑0.85 nm，外側(cè)親水，內(nèi)部疏水。脂多糖疏水鏈距離約0.49 nm，環(huán)糊精可以包裹脂多糖。由于分子篩效應(yīng)，環(huán)糊精不吸附DNA。通過其他分子共聚修飾，可以提高環(huán)糊精吸附效率［25］。

2.2 有機試劑萃取法

Triton X-100和Triton X-114是非離子表面活性劑，分子結(jié)構(gòu)中具有親水的聚乙二醇結(jié)構(gòu)和親酯的烴結(jié)構(gòu)，是一種兩親物質(zhì)。內(nèi)毒素分子的外層結(jié)構(gòu)脂質(zhì)A的烷基鏈與表面活性劑產(chǎn)生非極性相互作用，使內(nèi)毒素溶解，并同水相隔離。用Triton X-114或Triton X-100從溶液中萃取內(nèi)毒素時，需要進行多次萃?。?6］。

2.3 沉淀法

多價陽離子精胺和亞精胺是核酸凝聚試劑［27］。在一定條件下，精胺和亞精胺能與脫氧核糖核酸大溝嵌入結(jié)合，與鏈上的堿基和磷酸基進行鏈內(nèi)結(jié)合和跨鏈結(jié)合，形成致密的環(huán)狀螺旋結(jié)構(gòu)。由于精胺和亞精胺主要對DNA起作用而對RNA和內(nèi)毒素作用能力很弱，因此可用于從菌體裂解液中分離質(zhì)粒DNA，制備醫(yī)療級疫苗［28］。

有研究者通過篩選內(nèi)毒素在不同金屬鹽中沉淀情況，發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素去除效果依次是Mg2+＜Ni2+＜Ca2+＜ Zn2+＜ Cu2+，而DNA回收程度是Zn2+＞ Mg2+＞ Ca2+＞ Ni2+＞ Cu2+，且SO42-＞Cl-。研究結(jié)果表明，在中和后pH環(huán)境下，0.5 mol/L ZnSO4在15 ℃孵育30 min可以選擇性沉淀80%的內(nèi)毒素（＜0.05 EU/μg）［29］。

3 質(zhì)粒DNA純化的自動化

目前市面上有很多核酸自動純化儀，根據(jù)提取原理可大致分為離心柱型和磁珠型兩種。前者用于提取所有類別的核酸，特別是質(zhì)粒DNA；后者主要用于提取基因組DNA及病毒DNA/RNA。由于需離心去除變性的基因組/蛋白質(zhì)復(fù)合體，自動純化在質(zhì)粒DNA純化應(yīng)用上受到限制。質(zhì)粒DNA自動純化儀有兩款（表1）。其中，Qiagen QIAcube核酸自動純化儀內(nèi)置有離心機、加熱振蕩器、移液體系和自動抓取器，需配套相應(yīng)試劑盒和耗材，適用小提質(zhì)粒DNA。BenchPro?2100適用于大規(guī)模質(zhì)粒DNA純化，配套含陰離子交換膜的流體質(zhì)粒提取卡，采用一系列的捕獲和純化膜收集并裂解大腸桿菌，澄清裂解液，獲得轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒。

為了推動質(zhì)粒DNA自動化純化進展，很多研究者嘗試優(yōu)化純化方法。常規(guī)質(zhì)粒DNA純化離心步驟較多且費時，過濾是純化細(xì)菌裂解液較理想的方法，利用過濾柱進行過濾，吸附柱進行核酸吸附，可方便地達到過濾和核酸純化一體化操作，提高效率［30］?；蚪M/蛋白質(zhì)復(fù)合體絮狀沉淀直徑約為0.5～100 μm，使用8 μm孔徑濾膜可基本去除沉淀［31］。在高鹽環(huán)境中，應(yīng)用0.45 μm硝酸纖維素膜從裂解液中去除基因組DNA、RNA和內(nèi)毒素，還能用于去除聚乙二醇沉淀重懸后液相物質(zhì)和離子交換洗脫液中的雜質(zhì)［32］。Millipore 96通道的過濾板可以實現(xiàn)負(fù)壓抽濾提取300 μL菌液中的質(zhì)粒DNA［33］。由于傳統(tǒng)的磁珠法依然需要離心步驟，不適合高通量自動化提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA的發(fā)展方向，有研究表明，經(jīng)特殊修飾的磁珠可通過調(diào)節(jié)pH收集菌體并去除絮狀沉淀［34］。在有些研究中，大腸桿菌可不必從液體培養(yǎng)基中回收而連同培養(yǎng)基一起直接進行裂解處理，這種不需要去掉培養(yǎng)基的微量質(zhì)粒DNA提取法適用于高通量篩選或測序等工作。

表1 質(zhì)粒DNA自動純化儀Tab.1 Automatic plasmid DNA purification device

4 展望

質(zhì)粒是基因工程的重要載體，與病毒載體相比，具有安全性好、毒性低、免疫原性較低以及易于生產(chǎn)等優(yōu)勢，在臨床上廣泛用于基因治療和DNA疫苗的開發(fā)。隨著對質(zhì)粒DNA的深入研究，對質(zhì)粒DNA純化規(guī)模和產(chǎn)物純度提出了更高要求。傳統(tǒng)質(zhì)粒DNA純化技術(shù)存在著一些亟需解決的問題，包括高通量自動化設(shè)備的開發(fā)和藥用質(zhì)粒DNA的分離純化等。

基因疫苗的前期構(gòu)建需要大量的質(zhì)粒DNA篩選工作，傳統(tǒng)質(zhì)粒DNA純化方法是在實驗室中手工提取，其效率低且存在操作誤差，高通量自動化核酸提取和純化是發(fā)展趨勢。市場上僅有兩款質(zhì)粒純化儀，均是柱式法，存在的問題是通量不夠。基于磁性納米粒子的質(zhì)粒DNA提取方法在高通量自動化上具有一定的優(yōu)勢，不需要柱分離，特別適用于低拷貝質(zhì)粒DNA，但是目前磁珠法核酸自動純化儀僅可提取基因組DNA。近年來材料技術(shù)的發(fā)展，可克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，利用不同表面修飾納米粒子和相應(yīng)的緩沖體系，為實現(xiàn)質(zhì)粒DNA快速分離純化提供基礎(chǔ)。

經(jīng)過分離純化的質(zhì)粒DNA還達不到臨床醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)，需要精細(xì)純化技術(shù)。實驗室分離純化的質(zhì)粒DNA還包括一些與其性質(zhì)相似的雜質(zhì)，如帶負(fù)電RNA、內(nèi)毒素、尺寸相近的基因組等。色譜技術(shù)為藥用質(zhì)粒DNA精細(xì)純化提供了基礎(chǔ)。利用質(zhì)粒DNA的分子量、帶電性、疏水性和結(jié)構(gòu)特性與基因組、RNA、內(nèi)毒素等雜質(zhì)的差異進行分離，設(shè)計和篩選對質(zhì)粒DNA選擇性更高的親和配基，聯(lián)合兩個或多個色譜聯(lián)用技術(shù)均可為藥用質(zhì)粒DNA純化提供解決方案。另外，對于科研用無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA，市面上的試劑盒普遍操作繁瑣，對純化后內(nèi)毒素含量無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，后期應(yīng)當(dāng)考慮優(yōu)化操作和提高質(zhì)粒DNA回收率。

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