高熒+于宜平+苗久旺

摘要：目的探討姜黃素聯(lián)合PDTC體外抗K562細(xì)胞的作用。方法MTT法檢測姜黃素單獨(dú)或聯(lián)用PDTC后對K562細(xì)胞增殖活性的影響；Hoechst33342染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)；Western blot法檢測Cleaved Caspase 3的表達(dá)活性。結(jié)果10 μmol·L-1姜黃素聯(lián)合25 μmol·L-1的PDTC后，可顯著提高對K562細(xì)胞增殖的抑制活性，并顯示出誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，使細(xì)胞Cleaved Caspase 3表達(dá)增加。結(jié)論姜黃素聯(lián)合PDTC可增強(qiáng)抗K562細(xì)胞作用，機(jī)制與誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞：姜黃素；吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽；細(xì)胞凋亡；Caspase 3

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2018）01-0072-03

【Abstract】Objective： To study the effect of curcumin combined with PDTC on anti- leukemia K562 cells in vitro. Methods： MTT assay was used to detect the effect of curcumin alone or in combination with PDTC on the proliferation of K562 cells. The morphology of apoptotic cells was observed by Hoechst33342 staining. The expression activity of Cleaved Caspase 3 was detected by Western blot. Results： After treated with 10 μmol·L-1 curcumin and 25 μmol·L-1 PDTC， the inhibitory activity on proliferation of K562 cells significantly increased， and the morphological characteristics of abduction apoptosis were also proved. The expression of Cleaved Caspase 3 increased. Conclusion： Curcumin combined with PDTC can enhance the anti-K562 cells and its mechanism is related to the abduction apoptosis of K562 cells.

【Key words】curcumin，pyrrolidine dithiocarbamate，apoptosis， Caspase 3

核因子-kappaB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡有密切關(guān)系[1]。研究表明，吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）特異性抑制NF-κB后，對人白血病K562細(xì)胞的增殖有抑制作用、并可誘導(dǎo)凋亡，還可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥[2]。姜黃素及其類似物抗K562細(xì)胞作用明確、且呈多靶點(diǎn)性，但存在不穩(wěn)定、易降解、體內(nèi)吸收差、低濃度下抑制活性較弱的缺點(diǎn)[3，4]。采用高效低毒的中藥活性成分與腫瘤化療藥聯(lián)合應(yīng)用以減少化療藥的用量、提高化療效果、降低藥物不良反應(yīng)，是抗腫瘤藥物研究的重要方向。本文旨在采用低濃度的姜黃素聯(lián)合PDTC作用于白血病K562細(xì)胞，初步探討姜黃素聯(lián)合PDTC對抗K562細(xì)胞作用的影響，為治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料人白血病K562細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；姜黃素（sigma公司）；優(yōu)等胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone，Thermo公司）；MTT試劑盒（南京凱基生物公司）；Hoechst33342（sigma公司）；Cleaved Caspase 3（沈陽萬類生物科技有限公司）；PDTC、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、ECL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Actin、HRP（碧云天生物技術(shù)有限公司）。主要儀器有Multiscan MK 3-酶標(biāo)儀（Thermo公司）、IX51-倒置熒光顯微鏡（Olympus公司）、ImageQuant LAS 4000凝膠成像系統(tǒng)（GE公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將K562細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液（含10% 胎牛血清）中，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，長至對數(shù)生長期用于各實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/mL。隔夜后，加入終濃度為0、1、5、10、30、50 μmol·L-1的姜黃素，及10 μmol·L-1的姜黃素與15、25 μmol·L-1PDTC單用或聯(lián)用，空白組加入等體積不含藥物及細(xì)胞的培養(yǎng)基，每組均設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg·mL-1的 MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，加入100 μL SDS三聯(lián)液（10%SDS-5%異丁醇-0.012 mol·L-1 HCL），同時(shí)各組設(shè)置加藥但未加MTT對照孔，12h后，570 nm波長處檢測吸光度（A）值。按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率=[（空白組A值-藥物組A值）/空白組A值]×100%[5]。

1.4Hoechst33342染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)取對數(shù)生長期細(xì)胞，采用不同濃度藥物處理后，加入Hoechst 33342（5 μg·mL-1）染色液30 μL，于37℃避光孵育20 min，PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)后，取適量轉(zhuǎn)入96孔板，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。endprint

1.5Western blot方法檢測Cleaved Caspase 3的表達(dá)活性取對數(shù)生長期細(xì)胞，加藥后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，以PBS洗滌細(xì)胞2次，加入RIPA裂解液（含1 mmol·L-1的PMSF）冰上

裂解10 min。13000 r·min-1離心10 min，吸取上清，得到細(xì)胞總蛋白。用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取30 μg蛋白與上樣緩沖液混合，95℃變性5 min。12% SDS-PAGE凝膠中電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗后4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗室溫孵育50 min，TBST洗滌3次，每次10 min，加入ECL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑，置于凝膠成像系統(tǒng)成中成像[6]。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以形式表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)意義。

2結(jié)果

2.1姜黃素聯(lián)合PDTC可增強(qiáng)對K562細(xì)胞增殖的抑制作用K562細(xì)胞經(jīng)不同濃度姜黃素作用后，劑量依賴性抑制細(xì)胞增殖。但姜黃素低于10 μmol·L-1時(shí)對K562細(xì)胞增殖的抑制活性均較弱（圖1）。采用10 μmol·L-1姜黃素與15、25 μmol·L-1的PDTC聯(lián)用后，可增強(qiáng)對K562細(xì)胞增值的抑制作用，其中10 μmol·L-1姜黃素與25 μmol·L-1的PDTC聯(lián)用比PDTC單用對K562細(xì)胞的抑制活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.2姜黃素聯(lián)合PDTC可增強(qiáng)誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡作用不同濃度藥物作用于K562細(xì)胞48 h后，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，空白組細(xì)胞核熒光均勻、形態(tài)基本完整；10 μmol·L-1姜黃素組有少量細(xì)胞核熒光增強(qiáng)，表現(xiàn)出較弱的凋亡特征；25 μmol·L-1 PDTC組部分細(xì)胞核表現(xiàn)出亮藍(lán)色熒光，細(xì)胞核濃縮，呈現(xiàn)出凋亡特征；聯(lián)合用藥組細(xì)胞核濃縮、破碎，并出現(xiàn)凋亡小體，凋亡現(xiàn)象明顯，提示姜黃素聯(lián)合PDTC可增強(qiáng)誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡作用（圖2）。

2.3姜黃素聯(lián)合PDTC可增強(qiáng)誘導(dǎo)K562細(xì)胞的Caspases 3活化作用藥物作用于K562細(xì)胞48 h后，空白組及10 μmol·L-1姜黃素組誘導(dǎo)K562細(xì)胞Cleaved Caspase 3的表達(dá)較弱，與25 μmol·L-1PDTC聯(lián)合后作用增強(qiáng)，提示姜黃素聯(lián)合PDTC可增強(qiáng)誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved Caspase 3活性表達(dá)（圖3）。

3討論

慢性粒細(xì)胞白血病為惡性骨髓增殖性疾病，其發(fā)病率為1.6/10萬～2/10萬，占白血病發(fā)病總數(shù)的15%[7]?；瘜W(xué)治療是慢性粒細(xì)胞白血病的治療方法之一，但化療藥物常存在不良反應(yīng)大、耐藥等問題。NF-κB是細(xì)胞中重要的信號傳導(dǎo)因子，可通過基因調(diào)控發(fā)揮生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、參與免疫炎癥反應(yīng)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等[8]。NF-κB被抑制后，可通過調(diào)控線粒體膜蛋白如bcl-2等，繼而激活Caspases誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。文獻(xiàn)研究表明，NF-κB抑制劑PDTC具有抗K562細(xì)胞作用、可逆轉(zhuǎn)化療藥對K562細(xì)胞耐藥，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其作用機(jī)制之一。

姜黃素是一種具有良好應(yīng)用前景的天然多酚類物質(zhì)，抗腫瘤作用廣泛，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其重要機(jī)制。姜黃素可通過重塑多種分子靶點(diǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，包括上調(diào)死亡受體4/5、活化Caspase 3、促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放、抑制Bcl-2蛋白及c-Myc表達(dá)等[9]。但穩(wěn)定性差、水溶性差且口服給藥生物利用度較低等缺點(diǎn)，限制姜黃素抗腫瘤藥效的發(fā)揮。將姜黃素與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，作為惡性腫瘤治療的輔助用藥，用以增強(qiáng)化療藥的抗腫瘤效果、降低化療藥的毒副作用，是姜黃素臨床應(yīng)用開發(fā)研究的一個(gè)重要研究方向。研究表明，姜黃素可通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)、活化Caspase 3等機(jī)制誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡[10]。姜黃素聯(lián)合黃連素作用于K562細(xì)胞，兩者聯(lián)用對細(xì)胞增殖的抑制具有協(xié)同作用[11]。姜黃素亦可與三氧化二砷或氯尼達(dá)明聯(lián)合，降低線粒體膜電位，釋放凋亡活性物質(zhì)，激活線粒體凋亡途徑從而誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡[12]。已有研究將PDTC與姜黃素聯(lián)用，PDTC可顯著增強(qiáng)姜黃素對腎癌ACHN細(xì)胞的放射增敏作用[13]。

本研究采用姜黃素和PDTC聯(lián)合用藥，聯(lián)合用藥組對K562細(xì)胞的增殖抑制作用優(yōu)于姜黃素組和PDTC組，且10 μmol·L-1姜黃素與25 μmol·L-1的PDTC聯(lián)合后作用比較明顯，有顯著性差異，提示姜黃素聯(lián)合PDTC可增強(qiáng)抗K562細(xì)胞作用效果，從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase 3的表達(dá)方面證實(shí)兩者協(xié)同誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡為其增效機(jī)制。

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（收稿日期：2017-10-27）endprint