韓陽 高登峰 李明軍 倪亞萍

心血管疾病是全世界成人的首要致死因素，而高血壓是心血管疾病中最重要的危險因素[1]。研究顯示，2002年至2012年間，我國高血壓患病率每年增加1.4%，且北方人群患病率高于南方人群[2]。持續(xù)性高血壓可誘導(dǎo)血管重塑及血管功能不全，改變血管壁胞外基質(zhì)成分，同時誘導(dǎo)血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）表型轉(zhuǎn)化[3,4]。在血管重塑過程中，位于血管壁中間層的VSMC生長、增殖和遷移，同時合成大量細胞外基質(zhì)[5]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory elementbinding protein 1，SREBP1）是細胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝平衡[6]。研究發(fā)現(xiàn)，SREBP1介導(dǎo)了VSMC細胞內(nèi)膽固醇累積進而影響細胞正常功能，同時脂質(zhì)代謝失衡也改變VSMC細胞行為，誘導(dǎo)細胞增殖和遷移[7,8]。因此，我們猜測高血壓是否能夠通過影響VSMC內(nèi)SREBP1的表達，進而改變細胞表型、誘發(fā)血管重塑。本研究利用高血壓動物和細胞模型，探索SREBP1在VSMC表型轉(zhuǎn)化中的作用，以期為高血壓治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8周齡雄性C57BL/6J小鼠購自國家實驗動物種子中心，飼養(yǎng)于恒溫［（20±2）℃］、恒濕［（55±5）%］動物房中，12/12 h光周期，自由飲水、攝食。

1.1.2 試劑 血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）、纈沙坦、辣根過氧化物酶標記的第二抗體購自美國Sigma-Aldrich公司，蘇木素-伊紅染色液、聚偏氟乙烯膜（PVDF）、LY294002購自江蘇碧云天公司，LipofectamineTM2000、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ECL試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，SYBR PremixEx TaqⅡ購自大連寶日醫(yī)公司，第一抗體包括SREBP1抗體、Akt抗體、磷酸化Akt p-Akt抗體、α平滑肌肌動蛋白α-SMA抗體、骨橋蛋白OPN抗體、β-actin抗體購自美國Novus Biological公司，其余常見試劑均為國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組處理 將50只C57BL/6J小鼠隨機分為對照組、處理組1、處理組2、處理組3和纈沙坦組，每組10只。小鼠預(yù)先通過手術(shù)于背部皮下植入微滲透泵，處理組小鼠通過微滲透泵按照150 ng·kg-1·min-1（處理組1）、300 ng·kg-1·min-1（處理組2）、600 ng·kg-1·min-1（處理組3）的速率灌注AngⅡ（溶于0.9%生理鹽水），纈沙坦組小鼠按照600 ng·kg-1·min-1的速率灌注 AngⅡ，對照組小鼠則通過微滲透泵灌注生理鹽水，共處理28 d。纈沙坦組小鼠在灌注AngⅡ的同時通過灌胃方式給予40 mg·kg-1·d-1纈沙坦進行處理，對照組和處理組則灌注等體積蒸餾水。稱量小鼠體質(zhì)量，并檢測小鼠心率和血壓變化。

1.2.2 蘇木素-伊紅（HE）染色 取小鼠主動脈根部至主動脈弓血管，在中性甲醛溶液中進行固定，石蠟包埋后制成5 μm厚切片，將切片脫蠟至水后用蘇木素染液處理10 min，0.5%鹽酸乙醇處理10 s后伊紅染色5 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3 VSMC細胞分組處理 將VSMC細胞隨機分為正常組、處理組1、處理組2、處理組3、纈沙坦組、LY294002組、沉默對照組、沉默組。處理組細胞分別添加 0.1×10-6mol/L（處理組 1）、0.5×10-6mol/L（處理組 2）、1.0×10-6mol/L（處理組 3）AngⅡ處理24 h，纈沙坦組則在添加 AngⅡ（1.0×10-6mol/L）處理前用 1.0×10-6mol/L纈沙坦預(yù)處理 6 h，LY294002組在 AngⅡ（1.0×10-6mol/L）處理前用10 ng/ml LY294002預(yù)處理6 h，沉默對照組和沉默組細胞在AngⅡ（1.0×10-6mol/L）處理24 h前轉(zhuǎn)染scramble siRNA和SREBP1 siRNA，正常組添加等體積溶媒處理。

1.2.4 siRNA轉(zhuǎn)染 查找SREBP1基因序列（NM_011480.4），設(shè)計含BamⅠ和 HindⅢ酶位點的siRNA引物并合成siRNA，其中SREBP1 siRNA上游引物為 5′-GAT CCG ACA TGC TCC AGC TCA TCA TTC AAG ACG TGA TGA GCT GGA GCA TGT CTT TTT TGT CGA CA-3′，下游引物為 3′-GCT GTA CGA GGT CGA GTA AGT TCT GCA CTA CTC GAC CTC AAA AAA CAG CTG TTC GA-5′，產(chǎn)物長度65 bp，由華大基因合成。將擴增產(chǎn)物克隆到shRNA質(zhì)粒中并測序鑒定。VSMC細胞生長至80%融合時用于轉(zhuǎn)染，取5 μl LipofectamineTM2000稀釋到250 μl減血清MEM培養(yǎng)基，室溫下孵育5 min后加入8 μl siRNA，室溫共孵育20 min。將混合后的siRNA-Lipofectamine復(fù)合物加入到VSMC細胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖動混勻，37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)。

1.2.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析 利用Trizol試劑提取小鼠主動脈總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈作為qRT-PCR模板（10 μl反應(yīng)體系）。qRT-PCR 擴增體系（20 μl），包含上、下游引物各 0.5 μl，SYBR PremixEx TaqⅡ10 μl，模板 2 μl，ddH2O 7 μl。qRT-PCR 擴增條件：95 ℃ 2 min，94 ℃20 s，60℃ 20 s，40個循環(huán)；溶解曲線溫度 65℃～95 ℃。SREBP1（NM_011480.4）引物：上游 5′-GTA CCT GCG GGA CAG CTT AG-3′，下游 5′-GTC CAT TGC TGG TAC CGT GA-3′，產(chǎn)物長度 161 bp。β-actin（NM_007393.5） 引物：上游 5′-CCT AAG AGG AGG ATG GTC GC-3′，下游 5′-CTC AGA CCT GGG CCA TTC AG-3′，產(chǎn)物長度 155 bp。根據(jù)PCR反應(yīng)得出的循環(huán)閾值（cycle threshold value，Ct），由 2-ΔΔCt公式計算目的基因相對表達量。

1.2.6 免疫印跡檢測 取小鼠主動脈或VSMC細胞，添加 RIPA 裂解液［50 mM Tris（pH 7.4），150 mM氯化鈉，1%Triton X-100，1%去氧膽酸鈉，0.1%SDS，0.1 g/L PMSF］提取總蛋白，利用 Braford法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。電泳結(jié)束后將蛋白通過濕法轉(zhuǎn)移至PVDF上，隨后將PVDF膜用5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h。T-PBS漂洗3次，添加第一抗體在4℃中封閉過夜。本研究使用的第一抗體包括SREBP1抗體（1∶1000）、Akt抗體（1∶1000）、p-Akt抗體（1∶800）、α-SMA 抗體（1∶1000）、OPN 抗體（1∶1000）、β-actin抗體（1∶1000）。T-PBS漂洗 3次，添加辣根過氧化物酶標記的第二抗體（1∶5000）于37℃孵育2 h，ECL試劑盒顯影，利用Image J軟件檢測灰度值，計算相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 利用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均采用±s的方式表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并利用SNK－q檢驗進行兩兩比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高血壓小鼠體質(zhì)量、心率、收縮壓、舒張壓變化 與對照組比較，各處理組和纈沙坦組小鼠體質(zhì)量、心率水平無明顯變化（P＞0.05）。處理組1、處理組2和處理組3小鼠收縮壓和舒張壓水平明顯高于對照組（P＜0.05）。纈沙坦組收縮壓和舒張壓水平低于處理組（P＜0.05），但高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 高血壓小鼠生理指標檢測（±s）

表1 高血壓小鼠生理指標檢測（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與處理組 1、2、3 組比較，bP＜0.05

舒張壓（mm Hg）對照組 10 25.8±2.7 532.9±46.7 121.4±11.8 69.3±5.5處理組 1 10 24.3±3.6 541.2±50.1 132.4±12.7a 74.6±6.3a處理組 2 10 25.1±2.9 544.8±48.4 141.7±12.9a 82.1±4.9a處理組 3 10 24.8±3.5 546.5±47.3 149.6±11.5a 90.3±7.9a纈沙坦組 10 25.6±4.1 542.9±45.6 134.9±13.4ab 75.3±6.8ab組別 例數(shù) 體質(zhì)量（g）心率（次/min）收縮壓（mm Hg）

2.2 高血壓小鼠主動脈血管形態(tài)學觀察 與對照組比較，處理組小鼠主動脈血管壁增厚、管腔增大，血管重塑明顯。纈沙坦抑制血管重塑改變。見圖1。

2.3 高血壓小鼠主動脈血管SREBP1 mRNA和蛋白表達水平檢測 3個處理組主動脈血管SREBP1 mRNA水平均顯著高于對照組（P＜0.05），而纈沙坦組主動脈血管SREBP1 mRNA明顯低于處理組（P＜0.05）而高于對照組（P＜0.05）。SREBP1蛋白表達水平與mRNA的表達水平一致。見圖2～4。

2.4 小鼠動脈VSMC細胞SREBP1蛋白水平檢測相比于正常組，處理組細胞SREBP1蛋白水平明顯上升（P＜0.05）。纈沙坦組細胞SREBP1 mRNA水平低于處理組2和處理組3（P＜0.05），與處理組1無顯著差異（P＞0.05），同時高于正常組（P＜0.05）。見圖 5、6。

2.5 VSMC細胞PI3K/Akt信號影響SREBP1表達與正常組比較，處理組細胞磷酸化Akt水平明顯增高（P＜0.05），纈沙坦組細胞磷酸化Akt水平則低于處理組 （P＜0.05） 而高于正常組 （P＜0.05），LY294002組磷酸化Akt水平明顯低于正常組（P＜0.05）。與正常組比較，LY294002組SREBP1表達水平也明顯降低（P＜0.05）。見圖 7、8。

2.6 VSMC細胞SREBP1參與VSMC表型轉(zhuǎn)化 與正常組及沉默對照組比較，SREBP1 siRNA顯著降低VSMC細胞SREBP1蛋白表達水平（P＜0.05）。與正常組比較，處理組細胞α-SMA表達明顯降低而OPN表達則升高（P＜0.05），纈沙坦組細胞α-SMA表達高于處理組而OPN低于處理組；同時LY294002組和沉默組α-SMA表達均高于處理組和纈沙坦組，而OPN表達則降低（P＜0.05），與正常組無明顯差異。見圖9、10。

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin，RAS）是誘導(dǎo)高血壓和心血管疾病的關(guān)鍵性因素。AngⅡ是RAS的效應(yīng)物，刺激細胞的AT1R受體誘導(dǎo)不良心血管反應(yīng)，如降低組織血供、血壓升高、鈉潴留、內(nèi)皮功能不全和纖維化等[9]。本研究建立了AngⅡ處理小鼠高血壓模型，通過HE染色觀察到高血壓小鼠模型主動脈血管壁增厚，發(fā)生血管重塑，纈沙坦處理則可逆轉(zhuǎn)AngⅡ的作用。李洋等[10]發(fā)現(xiàn)，低劑量 AngⅡ（100 ng·kg-1·min-1）僅誘導(dǎo)小鼠血管重塑，但不影響小鼠舒張壓和收縮壓，高劑量AngⅡ（400 ng·kg-1·min-1）則可影響小鼠血壓和血管重塑。本實驗中低劑量組使用藥物劑量相對較高（150 ng·kg-1·min-1），同時觀察到小鼠血壓和血管變化。

在正常細胞中，SREBP1位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)并與SREBP裂解激活蛋白結(jié)合，當細胞固醇含量降低時，SREBP1釋放至高爾基體中酶解修飾，隨后進入細胞核中調(diào)控靶基因表達[6]。有研究也發(fā)現(xiàn)，SREBP1的表達與多種腫瘤如胰腺癌、子宮內(nèi)膜腫瘤、卵巢癌等惡性腫瘤細胞的生長有關(guān)[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠主動脈血管及VSMC細胞中SREBP1的表達水平隨著AngⅡ處理劑量增加而增高，并且其表達能被纈沙坦降低，說明了AngⅡ具有通過AT1R受體調(diào)節(jié)SREBP1表達的作用。AT2R是細胞中AngⅡ的另一個受體，其活化具有抑制VSMC生長的作用，需要進一步實驗證明AngⅡ是否也通過AT2R調(diào)控下游SREBP1的表達。

本研究利用PI3K特異性抑制劑LY294002處理VSMC細胞，細胞中磷酸化Akt的表達水平降低，證明LY294002可阻斷PI3K/Akt信號在細胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)。纈沙坦也可抑制PI3K/Akt信號活化，證明AngⅡ活化PI3K/Akt途徑是通過VSMC細胞中AT1R受體。與此同時，SREBP1的表達受到抑制，說明AngⅡ?qū)REBP1的調(diào)控依賴于PI3K/Akt信號途徑。磷酸化的Akt可通過兩條途徑調(diào)控SREBP1活性：①Akt通過下調(diào)泛素化酶Fwb-7的表達穩(wěn)定細胞核SREBP1蛋白，促進其靶基因的表達；②Akt可通過mTORC1調(diào)節(jié)SREBP1向細胞核轉(zhuǎn)移[6]。

在正常生理條件下，VSMC細胞呈現(xiàn)高度分化、低增殖性的收縮型表型。受到外界刺激后，如生長因子、絲裂原、炎癥介質(zhì)和機械力作用，VSMC則可能丟失收縮型表型，開始生長、分裂、遷移，同時合成大量細胞外基質(zhì)[14]。α-SMA是收縮型VSMC的標志蛋白，而OPN則是非收縮型（合成型）VSMC的標志蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ處理可下調(diào)VSMC細胞中α-SMA的表達而上調(diào)OPN的表達，纈沙坦和LY294002則可拮抗AngⅡ的作用，從而驗證了AngⅡ在VSMC表型轉(zhuǎn)化中的作用機制。此結(jié)果通過轉(zhuǎn)染SREBP1 siRNA直接敲低VSMC細胞中SREBP1的表達而進一步得到證明。研究發(fā)現(xiàn)，SREBP1能夠直接與TGF-β啟動子區(qū)結(jié)合啟動基因表達，從而改變細胞外基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)[15]。因此，SREBP1可能直接影響VSMC細胞外基質(zhì)而促進表型轉(zhuǎn)化。

綜上所述，AngⅡ誘導(dǎo)高血壓小鼠主動脈血管重塑和VSMC表型轉(zhuǎn)化，其中PI3K/Akt/SREBP1途徑介導(dǎo)了AngⅡ在VSMC表型轉(zhuǎn)化中的作用，從而可能為治療高血壓及相關(guān)的血管病變提供新的靶點。

高血壓小鼠動脈血管平滑肌細胞PI3K/Akt/SREBP1信號活化及表型轉(zhuǎn)化研究 P79

圖1 各組高血壓小鼠主動脈重塑變化（標尺 50 μm）

圖2 高血壓小鼠主動脈血管SREBP1 mRNA表達水平檢測

圖3 高血壓小鼠主動脈血管SREBP1蛋白免疫印跡條帶

圖4 高血壓小鼠主動脈血管SREBP1蛋白相對表達水平

圖5 各組VSMC細胞SREBP1蛋白免疫印跡條帶

圖6 各組VSMC細胞SREBP1蛋白相對表達水平

圖7 各組VSMC細胞磷酸化Akt和Akt蛋白免疫印跡條帶

圖8 各組VSMC細胞磷酸化Akt相對表達水平

圖9 各組VSMC細胞α-SMA和OPN蛋白免疫印跡條帶

圖10 各組VSMC細胞α-SMA和OPN蛋白相對表達水平

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