史冬玲，何冰倩，戴靈豪

(浙江中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥科學院， 浙江 杭州 311400)

1 脊髓損傷研究的現(xiàn)狀

脊髓損傷是脊柱損傷嚴重的并發(fā)癥之一。WHO數(shù)據(jù)顯示，每年世界各國有25萬～50萬的人遭受脊髓損傷。引起脊髓損傷的主要原因是交通事故、高空墜落和暴力損傷。脊髓損傷常伴隨癱瘓、大小便失禁等并發(fā)癥，給患者及其家庭帶來巨大的經(jīng)濟負擔。調(diào)查顯示，脊髓損傷越來越年輕化，給社會造成巨大壓力。但是，目前臨床上缺乏有效的治療措施。雖然科研工作者在脊髓損傷的治療上已經(jīng)做了很多的探索，但是所有的方法都顯示出了有限的療效，尤其是損傷后功能的恢復。因此，脊髓損傷治療新策略的研究是很有必要的。

2 細胞治療潛在的機制

脊髓損傷治療最大的挑戰(zhàn)就是軸突的再生和重新連接。干細胞具有的強壯的增殖和分化潛能使得干細胞移植技術(shù)在脊髓損傷的治療中開辟了新天地。多潛能間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是由間充質(zhì)干細胞和祖細胞組成的非造血細胞亞群，具有多能性特征，可以從骨髓、外周血、臍帶血、脂肪組織和皮膚等樣本中獲得。MSCs作為細胞治療的來源，對于大鼠脊髓損傷的治療具有較好的療效[1-2]。但是，干細胞的自體移植存在幾個問題，一是存活率低。移植的細胞只有小部分能夠存活[3]。二是具有產(chǎn)生腫瘤的風險。長時間培養(yǎng)的MSCs由于染色體不穩(wěn)定性增強可能會向永生化和自主化轉(zhuǎn)變，當注射到多器官的生物體中，可能會導致腫瘤的生成[4]。三是靶向性差，靜脈內(nèi)移植不能定向到達損傷部位[5]。如何能夠揚長避短，既能使用MSCs治療脊髓損傷的優(yōu)勢又能避免它帶來的弊端呢？

間充質(zhì)干細胞移植促進功能恢復不是因為分化成損傷的組織，而是通過分泌營養(yǎng)因子和細胞因子改善損傷微環(huán)境來間接地促進軸突的再生[6-7]。MSCs通過旁分泌的方式分泌的小分子物質(zhì)，如生長因子、趨化因子、細胞因子和胞外微囊泡等，可以促進細胞再生和血管生成[8]。

3 MSCs來源的外泌體(MSCs-exosomes)的形成與功能特點

MSCs的治療效果可能歸因于其強大分泌可溶性分子和外泌體的能力[7,9]。外泌體是由許多細胞類型分泌到細胞外環(huán)境中的直徑為40～100 nm的膜囊泡。它們對應于內(nèi)體隔室的內(nèi)部囊泡、多泡體，并在該細胞器與質(zhì)膜胞外融合時釋放。在細胞內(nèi)，它們是在隔離特定蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的過程中，通過內(nèi)體膜向內(nèi)萌芽而形成的。外泌體內(nèi)包裹有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和不同的核酸(mRNAs, miRNAs, lncRNAs)[10]。這些外泌體RNAs可以被不同的細胞攝取并可在靶細胞內(nèi)表達，同時外泌體作為信號分子的天然載體，在細胞間交流中起著關(guān)鍵性的作用[11]。和移植MSCs相比，MSCs-exosomes可以通過血腦屏障，更容易儲存和移植。多潛能間充質(zhì)干細胞來源的外泌體在多種疾病中都展現(xiàn)出治療潛能。在糖尿病小鼠的模型中，MSCs-exosomes可以逆轉(zhuǎn)海馬中神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的降解以及軸突的喪失[12]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中，MSCs-exosomes可促進皮質(zhì)神經(jīng)元軸突的生長[13]。在大鼠的腦卒中模型中，全身給予MSCs-exosomes促進神經(jīng)血管重塑和腦卒中后功能恢復[14]。三維立體培養(yǎng)的人骨髓來源的MSCs顯示出更多的外泌體分泌，并能促進創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的功能恢復[15-16]。這些結(jié)果均提示MSCs-exosomes可能是脊髓損傷的有希望的治療工具。

4 外泌體對于脊髓損傷的治療

4.1 MSCs-exosomes對于脊髓損傷的治療作用

4.1.1 MSCs-exosomes抗細胞凋亡作用：脊髓損傷的病理生理學機制是很復雜的，包括細胞凋亡炎性反應、血管損傷、興奮毒性、流體-解質(zhì)紊亂、線粒體功能障礙、鈣和其他一些過程。其中凋亡和炎性反應是脊髓損傷繼發(fā)性損傷的主要事件。細胞凋亡主要受上游Bcl-2家族和下游caspase家族的調(diào)控，其中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是細胞凋亡最常見的凋亡標志物。采用尾靜脈注射的方式將100 μg外泌體總蛋白植入到T10打擊模型的脊髓損傷大鼠內(nèi)，發(fā)現(xiàn)MSCs-exosomes處理減少了脊髓損傷后大鼠脊髓中TUNEL陽性細胞的數(shù)量。 同時，顯著抑制促凋亡Bax水平，而抗凋亡Bcl-2水平上調(diào)。 結(jié)果表明，MSCs-exosomes在脊髓損傷中起著抗細胞凋亡的作用[17]。

4.1.2 MSCs-exosomes抗炎作用：脊髓損傷后，血腦屏障受到損壞，受傷的脊髓可以迅速被來自血液的嗜中性粒細胞滲透。TNF-α陽性和IL-1β陽性細胞在脊髓損傷后脊髓周圍區(qū)域強烈上調(diào)[18]。TNF-α和IL-1β是重要的炎性介質(zhì)，可加強脊髓中的神經(jīng)細胞死亡。尾靜脈注射MSCs-exosomes可顯著下調(diào)促炎性細胞因子(TNF-α和 IL-1β)蛋白質(zhì)水平和上調(diào)抗炎細胞因子(IL-10)蛋白質(zhì)水平，在脊髓損傷后發(fā)揮抗炎作用[17]。

4.1.3 MSCs-exosomes促進血管生成作用：脊髓損傷后脊髓血供迅速中斷。研究表明促進脊髓微血管網(wǎng)絡的血管生成和重建可以增強脊髓損傷后的功能恢復。在肢體、腦卒中等缺血性疾病模型中，MSCs-exosomes顯示出促進血管生成的能力。在小鼠后肢缺血模型中MSCs-exosomes顯著增強小鼠缺血肢體的微血管密度[19]。 在大鼠腦卒中缺血模型中，MSCs-exosomes靜脈注射增強了血管生成并改善了功能恢復[14]。在大鼠脊髓損傷缺血模型中，尾靜脈注射MSCs-exosomes，脊髓灰質(zhì)的前角有大量PCNA/RECA-1陽性細胞增殖，暗示血管的生成。但是，通過外泌體在損傷后3 d的血管生成的提高是否有助于功能恢復，還需要進一步的探索[17]。

4.2 外泌體作為胞間通訊分子促進脊髓損傷后修復

大腦的功能依賴于神經(jīng)細胞之間的細胞間通訊。現(xiàn)在的體外證據(jù)表明，外泌體是由神經(jīng)元以一種取決于突觸活性的方式釋放的。這些外泌體可以被其他神經(jīng)元重新攝取。神經(jīng)元分泌的外泌體中所含的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA可直接改變攝取細胞中的信號傳導和蛋白質(zhì)表達。因此外泌體可以代表一個理想的神經(jīng)元間信號轉(zhuǎn)移的機制[20]。除神經(jīng)元外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞均可分泌外泌體，外泌體可以被其他神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞攝取，進行細胞間交流[20-22]。脊髓損傷后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷再生困難，主要原因是膠質(zhì)疤痕的抑制。磷酸酶和張力蛋白同系物(phosphatase and tensin homologues, PTEN)是一種抑癌基因，是神經(jīng)元再生的主要負調(diào)節(jié)因子，抑制其活性一直被認為是脊髓損傷的治療靶點。Goncalves MB等[23]利用神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞間外泌體交流的特性，使用視黃酸受體β (retinoic acid receptor beta, RARβ) 拮抗劑處理神經(jīng)元，神經(jīng)元中PTEN活性由于胞質(zhì)磷酸化作用而降低，同時外泌體的分泌增加。外泌體被星形膠質(zhì)細胞攝取，導致增殖受阻，從而減少膠質(zhì)疤痕的形成，促進脊髓損傷后運動和感覺功能的恢復。

4.3 外泌體作為siRNA載體促進脊髓損傷后修復

外泌體不僅可以作為體內(nèi)物質(zhì)的載體，同樣可作為外來物質(zhì)的載體，比如載送外源性遺傳物質(zhì)。外泌體介導的siRNA可以有效和特異性地到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并產(chǎn)生效應[24]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，來源于創(chuàng)傷性腦損傷和脊髓損傷受試者的腦脊液的外泌體中的炎性蛋白質(zhì)表達增加。炎性反應小體相關(guān)蛋白會通過外泌體的方式被釋放到腦脊液中，包括凋亡相關(guān)點樣蛋白 (apoptotic speck-like protein containing a caspase recruitment domain, ASC)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1, NLRP1) 和半胱天冬氨酸酶(caspase-1)。研究者將神經(jīng)元來源的裝載有抑制ASC表達的siRNA的外泌體經(jīng)股動脈注射到脊髓損傷的大鼠體內(nèi)，實驗數(shù)據(jù)顯示來自神經(jīng)元的外泌體可以通過血腦屏障，有效的在體內(nèi)遞送貨物，顯著降低脊髓損傷后炎性反應小體激活，并且降低了caspase-1激活和IL-1β的加工[25]。因此，外泌體提供了一種新的治療方法，即基于RNA的藥物來阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的炎性反應。

5 結(jié)論和展望

外泌體作為一種新的治療策略，對于脊髓損傷的治療展現(xiàn)出了一定的療效。與移植MSCs相比，MSCs-exosomes具有體內(nèi)存活期更長、低致癌性、高傳遞效率的優(yōu)勢。外泌體不僅可以通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，還可以通過基因修飾，提高治療效率。雖然目前外泌體對于脊髓損傷治療的直接報道還比較少，但是種種特征顯示外泌體對于脊髓損傷的治療研究前景很大。在以后的研究中可關(guān)注以下問題：第一，注意外泌體細胞來源和培養(yǎng)條件。實驗已經(jīng)表明外泌體的功能特性會受到細胞來源和培養(yǎng)條件的影響，例如三維培養(yǎng)。第二，外泌體是細胞間的通訊分子，但是外泌體誘導的治療效應所依賴的營養(yǎng)活性機制尚不明確。第三，外泌體以何種機制透過血腦屏障，含有siRNA的外泌體如何特異性到達靶細胞，以及哪些因素在脊髓損傷的治療中起主要作用等等。總之，外泌體提供了脊髓損傷治療研究的新方向。

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