劉伯齡+陳齊勇+付長(zhǎng)龍+劉少?gòu)?qiáng)+葉小偉+梁清+葉錦霞+李西海

【摘 要】目的：從Wnt/β-catenin信號(hào)通路探討?yīng)毣罴纳鷾嵛飳?duì)大鼠椎間盤(pán)退變軟骨細(xì)胞功能的影響。方法：①用水提加熱回流法制備獨(dú)活寄生湯水提物成分；②選取4周齡健康雄性SD大鼠30只，采用機(jī)械-酶消化法分離大鼠椎間盤(pán)軟骨組織，建立軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系并進(jìn)行鑒定；③RT-PCR、Western blot法分別檢測(cè)經(jīng)DKK-1抑制劑干預(yù)及（或）經(jīng)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA與蛋白含量的表達(dá)。結(jié)果：①椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞經(jīng)Ⅱ型膠原法染色后，陽(yáng)性對(duì)照組胞漿區(qū)域浸染為棕黃色；②RT-PCR、Western blot檢測(cè)結(jié)果示，與正常組比較，模型組Wnt4、GSK-3β、

β-catenin mRNA與蛋白含量表達(dá)顯著升高（P < 0.01）；與模型組比較，獨(dú)活寄生湯水提物組（100，200，400 μg·mL-1）的Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA與蛋白含量表達(dá)顯著降低（P < 0.01或P < 0.05），其中以200 μg·mL-1組的表達(dá)量最低（P < 0.01）。結(jié)論：獨(dú)活寄生湯水提物組可通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，下調(diào)大鼠椎間盤(pán)退變關(guān)節(jié)軟骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA與蛋白含量表達(dá)，從而延緩椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞退變。

【關(guān)鍵詞】 椎間盤(pán)退變性疾?。蛔甸g盤(pán)軟骨細(xì)胞；獨(dú)活寄生湯；Wnt/β-catenin信號(hào)通路；大鼠

Effect of Duhuo Jisheng Tang（獨(dú)活寄生湯）on the Regulation of Rat Intervertebral Disc Chondrocyte Wnt/β-catenin Signaling Pathway

LIU Bo-ling，CHEN Qi-yong，F(xiàn)U Chang-long，LIU Shao-qiang，YE Xiao-wei，LIANG Gui-qing，YE Jin-xia，LI Xi-hai

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effect of Duhuo Jisheng Tang（獨(dú)活寄生湯）water extract on the regulation of rat intervertebral disc chondrocyte Wnt/β-catenin signaling pathway.Methods：①Duhuo Jisheng Tang water extract was made by the water extraction and reflux method.②A total of thirty four-week-old healthy male SD rats used to isolate intervertebral disc cartilage tissue by mechanical enzymatic digestion method to establish in vitro culture system of chondrocytes for identification.③RT-PCR，Western blot were used to detect the expression of contents of Wnt4，GSK-3β and β-catenin mRNA intervened by DKK-1

inhibitor and induced by interleukin -1β.Results：①After typeⅡcollagen staining，the cytoplasmic domain of the intervertebral disc cartilage cells in the positive control group was disseminated yellowish brown.②RT-PCR and Western blot detect results showed that compared with the normal group，the expression of contents of Wnt4，GSK-3β，

β-catenin mRNA and protein increased significantly in the model group（P < 0.01）.Compared with the model group，the expression of contents of Wnt4，GSK-3β，β-catenin mRNA and protein in the Duhuo Jisheng group（100，200，400 μg·mL-1）decreased significantly（P < 0.01 or P < 0.05），

among which the content expression in the group of 200 μg·mL-1 was the lowest（P < 0.01）.Conclusion：Duhuo Jisheng Tang water extract can delay the cartilage cell degeneration of intervertebral disc by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway and down-regulating the content expression of Wnt4，GSK-3β，β-catenin mRNA and protein in degenerated articular cartilage of rat intervertebral disc.endprint

【Keywords】 degenerative disc disease；intervertebral disc chondrocyte；Duhuo Jisheng Tang（獨(dú)活寄生湯）；

Wnt/β-catenin signaling pathway；rats

椎間盤(pán)退變性疾?。ㄈ缪甸g盤(pán)突出癥）的根本病理變化是椎間盤(pán)退變，其中軟骨終板作為椎間盤(pán)的重要組成部分，在維持椎間盤(pán)正常功能方面發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，軟骨終板退變作為椎間盤(pán)退變的始動(dòng)因素成為新的熱點(diǎn)[1-2]。研究證實(shí)，椎間盤(pán)退變關(guān)鍵因素之一是椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞功能偶聯(lián)失衡，導(dǎo)致持續(xù)病理發(fā)生，凋亡與細(xì)胞分化異常，進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨塑形重建，椎體骨贅形成[3]。目前對(duì)椎間盤(pán)退變規(guī)律的研究較為滯后，確切的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展過(guò)程仍有待進(jìn)一步探討，臨床往往采取被動(dòng)的、對(duì)癥式的治療措施，在這些治療中，中醫(yī)藥是有效、安全、不良反應(yīng)少的常用方法，但迫切需要繼續(xù)深化其預(yù)防和治療機(jī)制的研究。

Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)控制著許多生命過(guò)程，包括生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病、衰老與死亡等；也包括細(xì)胞形態(tài)與功能的分化與維持、免疫、應(yīng)激、細(xì)胞癌變與細(xì)胞凋亡等[4]。在脊椎動(dòng)物骨骼系統(tǒng)發(fā)生過(guò)程中，Wnt家族的各成員在骨與軟骨發(fā)育過(guò)程中具有重要調(diào)節(jié)作用，其中Dickkof族（DKK-1）

作為該信號(hào)通路的抑制劑，可抑制Wnt與膜受體的結(jié)合，進(jìn)而阻斷該信號(hào)通路[5-8]。

獨(dú)活寄生湯出自唐·孫思邈《備急千金要方》，由獨(dú)活9 g，桑寄生、杜仲、茯苓、肉桂心、細(xì)辛、防風(fēng)、川芎、牛膝、當(dāng)歸、人參、秦艽、白芍、熟地黃、甘草各6 g組成，具有祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎、補(bǔ)氣血之功效[9]。諸藥合用，使外邪得除，肝腎得補(bǔ)，氣血得充，邪正兼顧，祛邪不傷正，扶正不留瘀，發(fā)揮“從本治痿，從標(biāo)治痹”作用，切中椎間盤(pán)退變性疾病的病因病機(jī)。該方長(zhǎng)期用于臨床，治療椎間盤(pán)退變性疾病有較好療效[10-11]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明其能延緩軟骨退變[12-13]，但作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，本文從Wnt/β-catenin信號(hào)通路探討?yīng)毣罴纳鷾嵛镎{(diào)控對(duì)大鼠椎間盤(pán)退變軟骨細(xì)胞功能的影響，有目的地調(diào)控其功能，對(duì)延緩軟骨終板以及椎間盤(pán)退變有著重要的基礎(chǔ)與應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量90～100 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK2014-0001（閩）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及主要試劑 獨(dú)活寄生湯（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院）；磷酸鹽緩沖液、DMEM/LOW GLUCOSE（HyClone）；TRIZOL（美國(guó)life）；異丙醇、無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)）；瓊脂糖（Biowest Agarose）；核酸染料（Solarbio）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker Ⅱ（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；WB玻板（美國(guó)BIO-RAD）；PMSF（蛋白酶抑制劑）、RISF（裂解液）、蛋白上樣緩沖液（Thermo）；30%聚丙烯酰胺、Tris（pH = 8.8與pH = 6.8）、SDS（十二烷基磺酸鈉）、10×電泳液、AP（過(guò)硫酸銨）、TEMED、50×TAE（碧云天生物有限公司）；10×TBST（Solarbio）；高效封閉液（康為世紀(jì)）；Wnt4、GSK-3β、β-catenin、GAPDH引物（上海生工）；一抗（兔抗）Wnt4、GSK-3β、β-catenin、β-actin（美國(guó)Abcam公司）；二抗（羊抗兔）（美國(guó)CST公司）；1-StepTMTransfer Buffer、ECL高效顯影液（美國(guó)Thermo）等。

1.3 主要儀器 DNA擴(kuò)增儀（9600型，美國(guó)PE）；低溫高速離心機(jī)（64R型，美國(guó)BECKMAN）；超純水裝置（MILLI-Q型，美國(guó)MILIPORE）；熒光倒置相差顯微鏡（Olympus，日本TKO）；無(wú)菌操作臺(tái)（AIRTECH型，蘇州安泰）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F型，蘇州安泰）；凝膠成像系統(tǒng)（GELDOC2000型，美國(guó)BIO-RAD）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（BIO-TEK ELX800型，美國(guó)BIO-Tek）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（BB16/BB5060型，德國(guó)Heraus）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 獨(dú)活寄生湯水提物的提取 稱(chēng)取獨(dú)活9 g，桑寄生、杜仲、茯苓、肉桂心、細(xì)辛、防風(fēng)、川芎、牛膝、當(dāng)歸、人參、秦艽、白芍、熟地黃、甘草各6 g，水回流提取2次，每次2 h，合并提取液，抽濾，濃縮成浸膏，60 ℃水浴蒸干至恒重，待經(jīng)低溫下研磨成粉末狀，精確稱(chēng)量浸膏50 mg，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的FBS培養(yǎng)基5 mL溶解，超聲10 min，再經(jīng)0.22 μL無(wú)菌濾嘴過(guò)濾后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，配?0 mg·mL-1獨(dú)活寄生湯水提物母液，備用。

2.2 軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛麻醉下脫頸椎處死SD大鼠（每次5只），分離頸、腰椎椎間盤(pán)軟骨終板，收集后經(jīng)剪碎至每單位體積1 mm3，PBS緩沖液沖洗至少

3次后移至無(wú)菌小培養(yǎng)皿中，按每皿2.5 mL加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶進(jìn)行消化，

15 mL離心管收集消化后的上清液（2 h 1次），

1500 r·min-1離心機(jī)離心5 min后棄上清液，移液器代液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清DMEM）狀態(tài)緩慢吹勻沉淀，經(jīng)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)（2×105·mL-1）

后種植原代軟骨細(xì)胞于培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)48 h后初次換液，鏡下觀察細(xì)胞鋪滿80%瓶底面積時(shí)，經(jīng)胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞傳代，本實(shí)驗(yàn)使用第2代軟骨細(xì)胞。

Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色：軟骨細(xì)胞（經(jīng)計(jì)數(shù)每毫升2500個(gè)）待爬片后，經(jīng)PBS沖洗3次，

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定30 min，再經(jīng)沖洗、裂解（0.1%破膜劑50 μL）20 min，沖洗后加入endprint

50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的H2O2反應(yīng)20 min，再次沖洗后經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的BSA封閉30 min，陽(yáng)性對(duì)照組加入含Ⅱ型膠原1∶200的一抗反應(yīng)過(guò)夜，陰性對(duì)照組加入PBS作為對(duì)照，后經(jīng)PBS沖洗3遍

后加入50 μL二抗（1∶200）反應(yīng)30 min，再次沖洗后以每張玻片50 μL DAB浸潤(rùn)10 min，再依次經(jīng)過(guò)漂洗、蘇木素復(fù)染、沖洗（PBS）、返藍(lán)2 s、常溫晾干、梯度酒精、二甲苯進(jìn)行脫水與透明后封片與觀察[6]。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)使用第2代軟骨細(xì)胞，經(jīng)鑒定后共分6組，分別為正常組，模型組，DKK-1抑制劑組，以及獨(dú)活寄生湯水提物低、中、高劑量組。除正常組外，其余各組均經(jīng)10 ng·mL-1濃度IL-1β造模，造模成功后，DKK-1抑制劑組加入

5 μg·mL-1濃度的DKK-1，獨(dú)活寄生湯水提物低、中、高劑量組分別加入100，200，400 μg·mL-1的獨(dú)活寄生湯水提物。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA

2.4.1 Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA引物設(shè)計(jì)與合成

2.4.2 RT-PCR方法 采用Trizol法進(jìn)行Total RNA提取，并使用核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行濃度檢測(cè)；逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR，依次使用移液槍準(zhǔn)確加入Mix 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DEPC水7 μL、cDNA 1 μL配制公共管，即每管20 μL。PCR為94 ℃ 4 min條件下首先進(jìn)行預(yù)變性，循環(huán)35次（94 ℃ 30 s、退火58 ℃ 30 s、72 ℃

45 s），后置于72 ℃ 10 min，并于4 ℃保存；制備1.5%瓊脂糖凝膠，上樣后，在100 V、70 mA、15 min條件下電泳，使用BIO-RAD Fluor-S TM MultiImager圖像分析儀下掃描，經(jīng)分析后拍照存檔。

2.5 Western blot檢測(cè)軟骨細(xì)胞Wnt4、GSK-3β、β-catenin表達(dá) 獨(dú)活寄生湯水提物（100，200，400 μg·mL-1）干預(yù)48 h后，提取各組軟骨細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行BCA蛋白定量；依次配制12%分離膠和5%濃縮膠并進(jìn)行灌板，快速插入梳子，排除氣泡后，置于室溫下凝固；上樣后進(jìn)行電泳，采用半干式進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完畢后，迅速取出膜并標(biāo)記蛋白面，后將其置于TBST中漂洗2遍。脫脂牛奶封閉2 h后洗膜，再將各條膜放入預(yù)先配置好的β-actin（1∶1000）、Wnt4（1 μg·mL-1）、GSK-3β（1∶5000）、β-catenin（1∶4000）的一抗中4 ℃冰箱搖床震蕩過(guò)夜，漂洗3次（每次

10 min）后置于二抗（1∶5000）封閉袋中室溫反應(yīng)1 h，再次漂洗3次（每次10 min），最后配制ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，在凝膠成像儀下曝光成像并分析儲(chǔ)存。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，2組間比較符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)，3組及以上組間比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨細(xì)胞觀察與鑒定 本實(shí)驗(yàn)第2代大鼠椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞鏡下觀察：分布均勻，邊界清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，呈明顯的鋪路石狀外觀；經(jīng)Ⅱ型膠原法染色后，陽(yáng)性對(duì)照組胞漿區(qū)為棕黃色，陰性對(duì)照組胞漿區(qū)顏色透明，以上可鑒定本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

3.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，獨(dú)活寄生湯水提物（100，200，400 μg·mL-1）作用于經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)退變的椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞后，可下調(diào)Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA含量表達(dá)。與正常組比較，模型組Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），

提示椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞在一定程度上發(fā)生退變，退變模型建立；而預(yù)加入DKK-1抑制劑組的Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA含量明顯低于模型組

（P < 0.01），提示預(yù)加入DKK-1抑制劑可在一定程度上抑制椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路；在Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA指標(biāo)上，與模型組比較，獨(dú)活寄生湯水提物組（100，200，400 μg·mL-1）的mRNA含量均明顯降低，尤其以200 μg·mL-1組的表達(dá)量最低（P < 0.01），提示獨(dú)活寄生湯水提物可通過(guò)調(diào)控Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)，在一定程度通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin途徑，進(jìn)而延緩大鼠椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞的退變進(jìn)程。見(jiàn)圖2。

3.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯

示，獨(dú)活寄生湯水提物（100，200，400 μg·mL-1）

作用于經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)退變的椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞后，可下調(diào)軟骨細(xì)胞內(nèi)Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白含量表達(dá)。與正常組比較，模型組Wnt4、GSK-3β、

β-catenin含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），提示軟骨細(xì)胞在一定程度上發(fā)生退變，退變模型建立；而預(yù)加入DKK-1抑制劑組的Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白含量明顯低于模型組（P < 0.01）；在Wnt4、GSK-3β、β-catenin指標(biāo)上，與模型組比較，獨(dú)活寄生湯水提物組（100，200，400 μg·mL-1）的蛋白含量均明顯降低，尤其以200 μg·mL-1組的表達(dá)量最低（P < 0.01），提示獨(dú)活寄生湯水提物可通過(guò)調(diào)控Wnt4、GSK-3β、β-catenin表達(dá)，在一定程度上調(diào)控Wnt /β-catenin途徑，進(jìn)而延緩大鼠椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞的退變進(jìn)程。見(jiàn)圖3。endprint

4 討 論

Wnt/β-catenin信號(hào)途徑與軟骨細(xì)胞的退變具有密切聯(lián)系[14-15]，其是否也在椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞退變過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用是我們關(guān)注的焦點(diǎn)。因此，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞，并經(jīng)Ⅱ型膠原法染色進(jìn)行鑒定。鑒于IL-1β可抑制軟骨細(xì)胞活性，并下調(diào)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原基因表達(dá)，同時(shí)亦可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶、炎癥因子和NO產(chǎn)物產(chǎn)生[16-17]，因此本實(shí)驗(yàn)使用10 ng·mL-1濃度IL-1β干預(yù)椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組在Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA與蛋白含量均明顯升高（P < 0.05），因此，IL-1β可作為一種塑造大鼠椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞退變模型的方式。Dickkof族（DKK-1）可通過(guò)間接減少可利用的輔助受體LRP的數(shù)量抑制Wnt與膜受體的結(jié)合而發(fā)揮作用，常被作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑，因此本實(shí)驗(yàn)采用5 μg·mL-1濃度的DKK-1影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路[18-20]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 μg·mL-1濃度的DKK-1可抑制經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)大鼠椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA與蛋白含量表達(dá)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活寄生湯水提物200 μg·mL-1

可顯著促進(jìn)正常軟骨細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1、CDK4、CDK6及P21 mRNA的表達(dá)[21]，故本實(shí)驗(yàn)在前期基礎(chǔ)上，以Wnt/β-catenin信號(hào)通路為基點(diǎn)，探討?yīng)毣罴纳鷾嵛铮?00，200，400 μg·mL-1）調(diào)控IL-1β誘導(dǎo)的大鼠椎間盤(pán)退變軟骨細(xì)胞功能的影響，結(jié)果顯示，獨(dú)活寄生湯水提物（100，200，400 μg·mL-1）干預(yù)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠椎間盤(pán)退變軟骨細(xì)胞48 h后，可明顯下調(diào)Wnt4、

GSK-3β、β-catenin mRNA與蛋白含量表達(dá)，其中以200 μg·mL-1組的表達(dá)最為顯著（P < 0.01），這也與前期研究相切合，提示獨(dú)活寄生湯水提物可通過(guò)影響Wnt/β-catenin途徑，進(jìn)而調(diào)控Wnt4、GSK-3β、β-catenin表達(dá)，在一定程度上延緩大鼠椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞的退變進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)在于獨(dú)活寄生湯水提物對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞影響，其藥理藥效作用是否亦可經(jīng)過(guò)體內(nèi)代謝而對(duì)椎間盤(pán)發(fā)揮影響，仍需要進(jìn)一步通過(guò)大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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收稿日期：2017-08-20；修回日期：2017-09-28endprint