童晨曦， 宋銀宏

(三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 病原與免疫學(xué)系, 湖北 宜昌 443002)

骨肉瘤(osteosarcoma, OS)是較常見的發(fā)生在青少年或兒童的一種骨惡性腫瘤，在小兒骨惡性腫瘤中最多見，目前骨肉瘤的治療通常以手術(shù)與化療為主。有資料顯示，非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的患者的長期存活率在65%～70%變化；然而，對于轉(zhuǎn)移性患者，其5年存活率則小于20%。轉(zhuǎn)移性病變的快速發(fā)展和對化療的抵抗是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，輔助化療對肺轉(zhuǎn)移患者作用十分有限[1]。這就使得研究新的治療骨肉瘤的方法顯的十分必要。近來一種新興的免疫治療方式，嵌合抗原受體基因修飾的T細(xì)胞(chimieric antigen receptor-modified T, CAR-T)療法在一些基礎(chǔ)及臨床研究中均有報(bào)道，現(xiàn)就這方面進(jìn)行概述。

1　CAR-T細(xì)胞免疫療法

免疫治療骨肉瘤方面已經(jīng)展現(xiàn)出了一些治療效果，過繼性T細(xì)胞治療(adoptive cell theapy, ACT)是一種有效的治療腫瘤的免疫治療方式[2]。CAR-T作為一種新興的過繼性免疫治療方法，近年來發(fā)展十分迅速， 它并不依賴通常使腫瘤耐受的常規(guī)治療途徑，并且在血液腫瘤領(lǐng)域已經(jīng)得到了成功的應(yīng)用。其中識別CD19靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞可以治愈B淋巴細(xì)胞白血病和淋巴瘤，CTL019也有希望在未來1～2年獲得FDA批準(zhǔn)上市[3]，這為將CAR-T細(xì)胞免疫治療技術(shù)廣泛推廣到血液腫瘤和實(shí)體瘤中帶來了希望。嵌合抗原受體(CAR)是由來源于單克隆抗體的細(xì)胞外單鏈可變片段(scFv)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成的合成受體。CAR-T細(xì)胞將單克隆抗體的抗原結(jié)合特性與T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)和自我更新能力相結(jié)合，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域通常衍生自T細(xì)胞受體CD3-ζ鏈，其可與共刺激分子例如CD28或41BB結(jié)合[4]。通常將僅含有CD3-ζ鏈信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域稱為第1代CAR，結(jié)合一個共刺激分子稱為第2代CAR，結(jié)合兩個共刺激分子稱為第3代CAR[5]。

CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤應(yīng)用中首先要選擇合適的靶分子。人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor- 2, HER2)、白細(xì)胞介素11受體α鏈(interleukin- 11 receptor α-chain, IL- 11Rα)、酪氨酸激酶樣孤兒受體1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1, ROR1)和神經(jīng)節(jié)苷脂2(ganglioside2, GD2)在骨肉瘤患者腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。因此，這些受體可能作為CAR-T細(xì)胞有效的治療靶點(diǎn)，以免疫治療骨肉瘤并抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[6,10,13,16]。

2　靶向骨肉瘤表面抗原的CAR-T細(xì)胞免疫治療的相關(guān)研究

2.1　人表皮生長因子受體2(HER2)

60%的骨肉瘤是HER2陽性，HER2陽性可能與骨肉瘤的不良預(yù)后有關(guān)。但是HER2基因位點(diǎn)在這種疾病中不擴(kuò)增，可將HER2靶向免疫治療擴(kuò)展到HER2陽性但對HER2抗體不敏感的腫瘤。有研究顯示，包含第2代CD28/CD3-ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的HER2-CAR-T細(xì)胞在臨床前動物模型中顯示出良好的抗腫瘤活性[6]。在犬骨肉瘤實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的HER2-CAR-T能以抗原依賴的方式識別和殺死HER2陽性的犬骨肉瘤細(xì)胞系[7]。但是，CAR-T療法臨床應(yīng)用的安全性問題仍是需要重視的。一項(xiàng)第2代HER2特異性CAR-T細(xì)胞的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究中，使用的CAR含有衍生自HER2特異性MAb FRP5的胞外域和CD28/CD3-ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。開始使用超低劑量的HER2-CAR-T細(xì)胞(1×104/m2)作為單一試劑，不使用IL- 2或細(xì)胞化療；然后逐漸增加HER2-CAR-T細(xì)胞的劑量，最高的細(xì)胞劑量達(dá)1×108/m2。發(fā)現(xiàn)高劑量的 HER2-CAR-T細(xì)胞的輸注是良好耐受的。這些細(xì)胞以劑量依賴的方式運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位并以低水平持續(xù)表達(dá)6周以上[8]。在多種細(xì)胞毒性藥物化療后，在患者外周血輸注HER2-CAR-T細(xì)胞是可行的；并且，用于患有HER2陽性骨肉瘤患者的HER2-CAR-T細(xì)胞的安全劑量高達(dá)1×108/m2。雖然沒有發(fā)現(xiàn)HER2-CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增的證據(jù)，但HER2-CAR-T細(xì)胞的確在一些患者體內(nèi)長時間存在。這些輸注產(chǎn)物的持久性也決定著CAR-T細(xì)胞治療腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移的有效性[9]。HER2特異性的CAR-T細(xì)胞在臨床研究中展現(xiàn)出了歸巢、一定限度的持久性和抗腫瘤的效果。改善構(gòu)建后T細(xì)胞的擴(kuò)增和持久性，會使CAR-T細(xì)胞在臨床應(yīng)用中有更好的治療效果。但某些因素，如：輸注給患者的CAR-T細(xì)胞劑量的多少；是否同時使用化療藥物和所使用的化療藥物的種類不同；是否輸注了IL- 2；不同種CAR的HER2特異性scFv衍生自不同的單克隆抗體，其結(jié)合表位不同等，可能使治療結(jié)果有差異。

2.2　白細(xì)胞介素11受體α鏈(IL- 11Rα)

IL- 11Rα是一個有前景的治療靶點(diǎn)，可應(yīng)用于治療骨肉瘤。相比于HER2而言，IL- 11Rα可能是一種治療或抑制骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移更好的靶點(diǎn)。因?yàn)檗D(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的生物學(xué)特征與原發(fā)性腫瘤的生物學(xué)特征不同，而在骨肉瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移中HER2表達(dá)較弱，IL- 11Rα高度表達(dá)。靶向HER2構(gòu)建特異性的CAR-T治療骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移可能效果并不佳。除消化道以外，IL- 11Rα在正常器官組織中不表達(dá)或者表達(dá)很低。但是，在骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移中過表達(dá)，是骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的功能靶標(biāo)[10]。用IL- 11肽來構(gòu)建IL- 11Rα-CAR，使用的肽結(jié)合IL- 11Rα作為細(xì)胞外受體識別信號，通過嵌合CD28共刺激結(jié)構(gòu)域和激活T細(xì)胞的CD3-ζ激活結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)；胞內(nèi)雙結(jié)構(gòu)域CD28和CD3-ζ的第2代CAR改善了T細(xì)胞活化[11]。IL- 11Rα-CAR-T細(xì)胞在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中能靶向殺死4個骨肉瘤細(xì)胞系，細(xì)胞毒性與IL- 11Rα在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)水平相關(guān)。靜脈注射IL- 11Rα-CAR-T細(xì)胞治療確定有骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的小鼠，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞凋亡和腫瘤明顯消退，并且沒有明顯的毒副作用[11]。但能否成功應(yīng)用到骨肉瘤患者還需要更多的臨床研究。前面提到HER2-CAR-T在Ⅰ/Ⅱ期臨床研究中的有效性，對相同細(xì)胞，用IL- 11Rα和HER2-CAR構(gòu)建雙特異性T細(xì)胞可能對治療是有益處的。最近關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建的一種雙特異性CAR-T，其并聯(lián)HER2和IL13Rα2的2個抗原識別結(jié)構(gòu)域，被稱為TanCAR-T。TanCAR-T細(xì)胞明顯表現(xiàn)出比單一特異性CAR-T細(xì)胞更強(qiáng)的抗腫瘤活性[12]。但由于IL- 11Rα不是100%表達(dá)在每一個骨肉瘤細(xì)胞上，這需要有更多的研究來查明HER2是否在IL- 11Rα-OS細(xì)胞中表達(dá)，以及HER2定向的T細(xì)胞的識別和殺傷腫瘤細(xì)胞能力。

2.3　酪氨酸激酶樣孤兒受體1(ROR1)

ROR1在包括尤文肉瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤和纖維肉瘤的肉瘤細(xì)胞系中高度表達(dá)，而且其在正常成人組織中的表達(dá)有限。增加親和力的ROR1-CAR-T細(xì)胞對骨肉瘤模型小鼠具有顯著的抗腫瘤功效[13]。用獼猴構(gòu)建的骨肉瘤靈長類動物模型，研究了B細(xì)胞前體、脂肪細(xì)胞、胰腺和肺中低水平的ROR1表達(dá)是否會導(dǎo)致毒性反應(yīng)或影響ROR1-CAR-T細(xì)胞的存活與功能。結(jié)果證明，ROR1-CAR-T細(xì)胞在靈長類動物中是安全的，構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞同樣有抗腫瘤效果[14]。應(yīng)用到臨床還需進(jìn)一步了解ROR1在正常組織的具體表達(dá)和預(yù)防靶向的毒性等問題。有幾種可以減少CAR-T細(xì)胞靶毒性的策略在小鼠模型已經(jīng)被證明有效，包括自殺基因的共表達(dá)；使用mRNA轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，限制CAR只在轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞中表達(dá)來減少毒性反應(yīng)；以及包括基于PD- 1和CTLA- 4的抑制性CAR(iCARs)的策略[15]。目前雖不明確這些方法在臨床CAR-T治療已經(jīng)出現(xiàn)毒性反應(yīng)的患者時能否發(fā)揮作用，但可以在治療可能出現(xiàn)毒性反應(yīng)的患者時，預(yù)防性地構(gòu)建這些減少毒性反應(yīng)的策略。

2.4　神經(jīng)節(jié)苷脂2(ganglioside2, GD2)

GD2是骨肉瘤的CAR-T免疫治療又一個有前景的靶點(diǎn)。GD2在兒童和成人多種實(shí)體瘤中過表達(dá)，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤和骨肉瘤中過表達(dá)。在干細(xì)胞、神經(jīng)元、一些神經(jīng)纖維和皮膚的基底層中也發(fā)現(xiàn)存在GD2[16]。骨肉瘤小鼠模型中使用含有14g2a-scFv與CD28、OX40和CD3ζ信號結(jié)構(gòu)域的第3代GD2-CAR加全反式維甲酸(ATRA)的聯(lián)合治療顯著提高抗腫瘤效果[17]。這種聯(lián)合治療方式在其他靶點(diǎn)構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞也可以進(jìn)行嘗試。但要應(yīng)用到臨床，還需研究清楚因?yàn)镚D2廣泛的表達(dá)，在靶向治療時可能引起的不良反應(yīng)以及構(gòu)建的T細(xì)胞在體內(nèi)有無廣泛的殺傷作用等問題。

將多種治療方法聯(lián)合應(yīng)用到骨肉瘤患者可能取得更好的治療效果。免疫治療方法和常規(guī)治療方法相結(jié)合是一種治療骨肉瘤的思路；多種免疫治療方法的聯(lián)合也有可能增強(qiáng)單一免疫治療的效果。如CAR-T細(xì)胞和一種或者多種用于免疫治療的免疫檢查點(diǎn)抑制抗體聯(lián)合使用。目前有Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)測試單獨(dú)的PD- 1抗體或與CTLA- 4抗體的組合用于治療患有骨肉瘤和其他實(shí)體瘤的兒童、青少年和年輕成人的安全性和功效。使用PD- 1和/或CTLA- 4抗體與CAR-T細(xì)胞組合用于骨肉瘤的免疫治療的臨床試驗(yàn)也可能在近期進(jìn)行[18- 19]。

3　存在問題及展望

相比于傳統(tǒng)過繼性T細(xì)胞治療，CAR-T 細(xì)胞的scFv結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合靶細(xì)胞表位，并且不需要MHC的抗原呈遞。因此，CAR-T細(xì)胞可以克服由于HLA下調(diào)而導(dǎo)致的腫瘤逃逸[20]。CAR-T細(xì)胞識別抗原也更加廣譜，不需要繁瑣的分離程序，且可以在體內(nèi)長久存在，持續(xù)殺傷腫瘤細(xì)胞。這些都是傳統(tǒng)的免疫療法無法達(dá)到的。但是CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤上的應(yīng)用也存在著一些挑戰(zhàn)。例如，CAR-T細(xì)胞治療會產(chǎn)生不良反應(yīng)。原因之一在于T細(xì)胞活化殺傷過程中釋放大量細(xì)胞因子，嚴(yán)重時需要白細(xì)胞介素6(IL- 6)中和抗體tocilizumb來降低不良反應(yīng)；CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤時，更應(yīng)該注意脫靶效應(yīng)造成患者正常組織的損傷。研究如何避免這些因素的影響將會給免疫治療骨肉瘤帶來新的啟示。如何明確骨肉瘤靶點(diǎn)，使CAR-T細(xì)胞具有特異性殺傷能力，準(zhǔn)確靶向腫瘤細(xì)胞；如何使CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)增，持續(xù)產(chǎn)生效應(yīng)等都是臨床應(yīng)用CAR-T細(xì)胞免疫治療骨肉瘤所不能忽視的問題。

免疫治療腫瘤近年來已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，但是還沒有達(dá)到對腫瘤治療起決定性的作用。骨肉瘤仍然是難以治愈的惡性腫瘤之一，攻克這一問題依然充滿著挑戰(zhàn)。但是有這么多基礎(chǔ)和臨床研究已經(jīng)證明了CAR-T細(xì)胞免疫治療對骨肉瘤具有較好的殺傷作用，堅(jiān)信隨著免疫治療手段的進(jìn)一步發(fā)展，解決好臨床應(yīng)用中的不足，CAR-T細(xì)胞免疫療法將對治療骨肉瘤作出突出貢獻(xiàn)。