潘永娜

（遼寧省大連市普蘭店區(qū)動物疫病預防控制中心，遼寧 大連 116200）

獸醫(yī)實驗室中，常利用瓊脂凝膠免疫擴散試驗對馬傳染性貧血病進行診斷和檢疫。

1 定義與原理

將可溶性抗原與相應的抗體混合，當兩者的比例合適，并有鹽類存在時，即有沉淀物出現(xiàn)，這種現(xiàn)象叫做沉淀反應。沉淀反應中的抗原叫沉淀原，與沉淀原起反應的抗體叫沉淀素。

主要是采用雙向雙擴散試驗，即用已知抗原、陽性血清、待檢血清在瓊脂凝膠中進行免疫雙擴散，室溫下作用24小時，當已知抗原和陽性血清間出現(xiàn)明顯沉淀線，抗原和待檢血清間也出現(xiàn)沉淀線且與陽性血清沉淀線相連，表明待檢血清中有相應抗體。

2 操作細節(jié)

2.1 試 劑

（1）標準陽性血清、標準陰性血清、瓊脂擴散抗原：指定生物制品廠購買

（2）受檢血清：采血分離血清，4℃冷藏保存不含防腐劑和抗凝劑

（3）瓊脂糖、硫柳汞：分析純

（4）pH7.4 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）

2.2 器械和設備

（1）培養(yǎng)箱

（2）平皿：規(guī)格直徑90mm，潔凈滅菌

（3）打孔器：七孔梅花形、孔徑約5mm，孔距為3mm

（4）分析天平

（5）微量移液器及吸頭

（6）三角燒瓶

（7）酒精燈

2.3 操作步驟（方法）

（1）凝膠的配制：取瓊脂糖1.0g，直接加入含有0.1‰硫柳汞的100mL的PBS中，用熱水浴溶化混勻。

（2）制板（澆板）：將平皿放在水平臺上，每平皿倒入熱溶化的瓊脂液15～18mL，厚度約2.5mm左右,自然冷卻。

（3）打孔 ：在瓊脂板上選好位置，用打孔器打孔。用直徑3mm打孔器，孔間距為5mm。

（4）挑孔：挑出孔內(nèi)瓊脂，注意不要挑破孔緣。

（5）封底：為防止?jié)B漏，將打孔后的瓊脂板在酒精燈火焰上方快速來回5～7次加熱封底。

（6）滴加抗原和血清：在七孔型的中央孔中加抗原，外周 2、4、6 孔加標準陽性血清，1、3、5 孔分別加被檢血清。以加樣槍吸取樣品加入孔內(nèi)，注意不要產(chǎn)生氣泡，加至孔滿為止，加少了，影響反應程度，加多了，易溢出，也影響反應結(jié)果。平皿加蓋，待孔中液體吸干后，將平皿倒置，瓊脂板放入濕盒中。置15℃～30℃條件下進行反應，逐日觀察3d，在強光暗背景下觀察沉淀線，并記錄結(jié)果。

2.4 結(jié)果判定

（1）陽性：標準陽性血清孔與抗原孔之間有一條明顯致密的沉淀線，受檢血清孔與抗原孔之間形成一條沉淀線；或者陽性血清的沉淀線末端在毗鄰的被檢血清孔處向抗原孔偏彎者。

（2）陰性：被檢血清孔與抗原孔之間不形成沉淀線，或者標準陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線向毗鄰的受檢血清孔直伸或向受檢血清孔側(cè)偏彎者。

3 注意事項

（1）制備瓊脂板時注意不要產(chǎn)生氣泡，冷凝后加蓋，把平皿倒置，防止水分蒸發(fā)，否則影響抗原抗體在瓊脂內(nèi)的自由擴散。放在普通冰箱中可保存2周左右。

（2）瓊脂用打孔器打開孔后，一定要對孔的底部進行封口，以防血清滲漏。

（3）向孔中加血清或抗原時，均以加滿而不溢出為度，否則會影響反應效果。

（4）在觀察結(jié)果時，最好從不同折光角度仔細觀察平皿上抗原孔與受檢血清孔之間有無沉淀線。

（5）被檢血清要求新鮮、清亮透明、無溶血、防止細菌污染、并且避免反復凍融。對冰凍保存的血清融化后，應充分混勻，可以采用上下顛倒的方式混勻。

（6）溫度沉淀線的形成有影響，在一定范圍內(nèi)。

（7）標陽血清：能與合格抗原在12h內(nèi)產(chǎn)生明顯致密沉淀線的傳貧馬血清，做8倍以上的稀釋仍保持陽性反應者為宜。小量分裝，凍結(jié)保存。

（8）配制成的瓊脂液，可裝瓶中用膠塞蓋好，以防水分蒸發(fā)，待使用時，現(xiàn)溶化現(xiàn)制板。