楊德慧 古梓婷 賴勝敏 羅 利 馬宇昕 劉 靖

(廣東藥科大學基礎學院人體解剖學教研室, 廣州 510006)

在中樞神經系統(tǒng)中,髓鞘是由少突膠質細胞的突起纏繞神經元軸突所形成的管狀節(jié)段性結構,其主要成分是70%脂類和30%蛋白質構成的鞘磷脂結構[1],而有髓神經纖維是大腦白質的重要組成部分。目前,檢測髓鞘脂類表達的方法有多種,其中勞克堅牢藍(luxol fast blue, LFB)染色是一種較為常用的髓鞘染色方法[2-3]。但LFB染色也有不同的復染方法,其染色效果亦有差異。本研究通過對成年鼠和幼鼠2種不同鼠齡階段的大腦髓鞘LFB染色,比較焦油紫和伊紅2種不同復染方法的優(yōu)缺點,為相關研究提供合適的染色方法。

1 材料和方法

1.1 試劑和動物

LFB髓鞘染色液(G3245和G3240)購于Solarbio公司。6周齡SPF級SD大鼠購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心,許可證號SCXK(粵)2013-0002,自由攝食和飲水。雌鼠與雄鼠合籠后單籠飼養(yǎng),在分娩后第14天(分娩當天為0d)對母鼠和仔鼠進行取材。本研究經廣東藥科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 動物取材

仔鼠出生后第14天,母鼠和仔鼠在10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉下,以0.9%生理鹽水沖洗和4%多聚甲醛溶液灌注,灌注固定后取腦置于4%多聚甲醛中固定48h,組織常規(guī)脫水和石蠟包埋,用于堅牢藍染色。

1.3 LFB染色及復染

(1) 腦組織切片脫蠟至水： 二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15min;100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇各5min。(2) 切片轉入LFB染色液,在56℃恒溫烘箱染色24h。(3) 腦組織切片入95%乙醇洗去多余的染色后換雙蒸水洗。(4) 腦組織切片分別入Luxol分化液、70%乙醇分色30s和1min,水洗、鏡檢至最佳效果。(5) 復染： 焦油紫復染法,組織切片入新配的焦油紫染色約1min,在顯微鏡下觀察到明顯的細胞核和尼氏小體。隨著焦油紫使用次數(shù)的增加,染色時間可適當延長。伊紅復染法,組織切片入新配的伊紅復染約2min,切片被染成淡紅色,與LFB染色重疊部分顯示為藍紫色。(6) 雙蒸水洗3次后,切片用95%、100%乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封固。

2 結果

2.1 母鼠胼胝體和內囊LFB染色

胼胝體LFB染色呈藍色絲狀物,從胼胝體向皮質下白質延伸。內囊LFB染色呈斑塊狀、蕁麻疹樣分布。在焦油紫復染的切片中,LFB染色呈深藍色,髓鞘脂類較少的部位染成淺藍色,背景為白色,可見細胞核和尼氏小體分布(圖1，見封底)。伊紅復染的LFB染色中,LFB染色呈藍紫色,背景為紅色,脂類減少的部位被伊紅填充為紅色(圖2,見封底)。

2.2 仔鼠胼胝體和內囊LFB染色

幼鼠胼胝體和內囊髓鞘均還處在發(fā)育時期,其染色尚不具有成鼠的形態(tài),焦油紫法中LFB染色呈淺藍色,細胞核和尼氏小體為藍色(圖2,見封底);伊紅法的LFB染色呈藍紫色,背景為紅色(圖2,見封底)。

3 討論

髓鞘染色在白質性腦病的診斷和研究中具有重要作用,可用于檢測髓鞘發(fā)育的情況和脫髓鞘的程度。髓鞘染色常用的方法主要包括脂溶性染料浸染法、媒染法以及鋨酸與類脂的特異反應等[2-3]。LFB染色屬于脂溶性染料浸染法中的一種,盡管染色的具體步驟和時間等方法還有待于統(tǒng)一,但LFB染色的確是一種比較常用而可靠的髓鞘染色方法[4-5]。此外,也有研究使用油紅O進行髓鞘染色,但油紅O染色需要進行冰凍切片、配制油紅O染液中的異丙醇易揮發(fā)且對人體健康有害、切片不能長期保存,而LFB染色可以避免這些缺點[6]。LFB屬于銅酞菁染料,在乙醇溶液內能夠與髓鞘磷脂結合,染色后髓鞘著色鮮明,且有一定的特異性。與其他染色方法相比較,LFB染色具有操作簡單、價格低廉和著色鮮明易于觀察等優(yōu)點[1]。在LFB染色過程中,Luxol分色是關鍵步驟,能夠決定實驗的成功與否。但不同的復染方法所產生的背景不同,顯示LFB染色的鮮明度不同,特別是在幼鼠髓鞘發(fā)育尚未發(fā)育成熟的情況下,對LFB染色的敏感度要求更高。因此,本實驗通過對LFB染色檢測正常成年鼠和幼鼠大腦髓鞘,比較焦油紫和伊紅2種復染方法的優(yōu)缺點。

伊紅是一種酸性化合物,容易與堿性的細胞質結合呈現(xiàn)紅色,與LFB染色部分重疊顯示為藍紫色,藍紫色與紅色形成鮮明對比。焦油紫是一種堿性染料,能夠與細胞中酸性物質結合,將神經元的尼氏體、核仁染成藍色。在本實驗中,焦油紫和伊紅兩種復染方法均能清晰地顯示母鼠胼胝體和內囊的LFB染色,與皮質部分界限清楚。然而在白質中髓鞘脂類減少的部位,焦油紫法LFB染色呈現(xiàn)淺藍色,與深藍色部分區(qū)分不夠明顯。而在伊紅法中,脂類減少的部位被伊紅所填充,與藍紫色LFB染色形成鮮明的對比,更具直觀性。另外,幼鼠由于髓鞘尚未發(fā)育成熟,LFB染色著色少且淺,焦油紫法的LFB染色呈淺藍色,顏色較接近細胞核和尼氏小體。伊紅法的LFB染色呈藍紫色,與紅色的伊紅形成更鮮明的對比。在脫髓鞘和髓鞘發(fā)育的相關研究中,伊紅復染法更能夠敏感地反映出髓鞘LFB染色的變化,如果單純研究脫髓鞘或者髓鞘的發(fā)育,可以應用伊紅復染法。而焦油紫復染法可以觀察到神經元細胞核和尼氏小體的變化,適用于研究脫髓鞘與神經元損傷、髓鞘再生與神經元再生之類的相關研究[7]。因此,可以根據實驗目的不同而來選擇合適的LFB復染方法。