賈陽杰 呂亞麗 劉麗宏

[摘要] 目的 探討人巨細(xì)胞病毒（HCMV）感染人胚肺成纖維細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況，以及姜黃素對(duì)HCMV感染細(xì)胞后細(xì)胞凋亡的影響。 方法 將細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組（細(xì)胞維持液），病毒模型組（細(xì)胞維持液+HCMV），姜黃素大（細(xì)胞維持液+HCMV+姜黃素0.8 μg/mL）、中（細(xì)胞維持液+HCMV+姜黃素0.4 μg/mL）、?。?xì)胞維持液+HCMV+姜黃素0.2 μg/mL）劑量組，更昔洛韋組（細(xì)胞維持液+HCMV+更昔洛韋50 μg/mL），運(yùn)用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）和熒光染料碘化丙啶（PI）法檢測姜黃素對(duì)HCMV感染的細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果 JC-1法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HCMV感染早期，病毒模型組細(xì)胞凋亡情況與細(xì)胞對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與病毒模型組比較，更昔洛韋組和姜黃素大、中、小劑量組細(xì)胞凋亡顯著增加（P < 0.05）。HCMV感染晚期，與細(xì)胞對(duì)照組比較，病毒模型組細(xì)胞凋亡顯著增加（P < 0.05）；與病毒模型組比較，姜黃素大、中、小劑量組細(xì)胞凋亡均有不同程度降低，其中姜黃素大劑量組與病毒模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。熒光染料PI法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在HCMV感染早期及晚期，與細(xì)胞對(duì)照組比較，病毒模型組S期細(xì)胞顯著增多（P < 0.01）；與病毒模型組比較，姜黃素大、中、小劑量組S期細(xì)胞均明顯減少（P < 0.05）。 結(jié)論 姜黃素能夠?qū)笻CMV感染引起的細(xì)胞凋亡作用，可使HCMV感染早期誘導(dǎo)的抗凋亡作用和HCMV感染晚期誘導(dǎo)的促凋亡作用減弱。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素；人巨細(xì)胞病毒；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）12（a）-0004-07

細(xì)胞凋亡（apoptosis），又稱程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD）是指細(xì)胞主動(dòng)死亡的現(xiàn)象。機(jī)體出現(xiàn)細(xì)胞凋亡主要是為了能夠保持組織、器官的正常形態(tài)、功能和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[1]。大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體感染人巨細(xì)胞病毒（HCMV）后產(chǎn)生的臨床表現(xiàn)，跟PCD的發(fā)生密切相關(guān)[2]。

HCMV是β皰疹病毒亞科的雙鏈線狀DNA病毒。在大多數(shù)發(fā)達(dá)國家，大約50%的成年人既往感染HCMV，在世界發(fā)展中地區(qū)，HCMV感染在大齡兒童和成年人群中甚至高達(dá)90%～100%[3]。HCMV一旦侵入人體將長期或終身存在于體內(nèi)，正常人一般為潛伏感染或無癥狀的亞臨床感染，而在放化療后、器官移植術(shù)后的腫瘤患者等免疫功能不全或低下的易感人群中，感染HCMV后常常引起多系統(tǒng)的病變，甚至造成致死性的危險(xiǎn)[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，HCMV感染后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)并不能將其全部消滅清除，并且HCMV還可以潛伏于細(xì)胞中[5]。HCMV與PCD密切相關(guān)且兩者之間的聯(lián)系較為復(fù)雜，研究者發(fā)現(xiàn)，HCMV感染后，在不同的條件下，既可表現(xiàn)為抑制細(xì)胞的凋亡，也可表現(xiàn)為加快細(xì)胞的凋亡[6]。姜黃素是從姜黃屬中提取出的一種酚性色素，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用。故本研究擬通過運(yùn)用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）和熒光染料碘化丙啶（PI）的方法來探討HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況，以及姜黃素對(duì)HCMV感染細(xì)胞后細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 病毒及細(xì)胞

HCMV AD169株由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦科和兒科臨床病毒研究室提供。人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF株）購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源中心，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為20～25代細(xì)胞。

1.2 藥物

注射用更昔洛韋（GCV）（美國Sigma公司，貨號(hào)：Y0001129）；姜黃素單體（批號(hào)：062-20170321，含量99.116%）由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院（以下簡稱“我院”）藥事部自制；姜黃飲片來自江西江中中藥飲片有限公司，由我院中草藥房藥師鑒定為真品，批號(hào)：160801，GMP證號(hào)：贛JX20120017。

1.3 主要試劑及儀器

MEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青霉素G（Penicillin G）、Hank′s液、鏈霉素（Streptomycin）、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）均購自美國Sigma-Aldrich公司；JC-1購自北京泛博生物化學(xué)有限公司；PI染色液購自美國Sigma公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。細(xì)胞培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)基+Penicillin G（100 U/mL）+Streptomycin（100 μg/mL）+10%FBS。細(xì)胞維持液為MEM培養(yǎng)基+Penicillin G（100 U/mL）+Streptomycin（100 μg/mL）+2%FBS。

1.4 JC-1法檢測細(xì)胞凋亡

將HELF細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)成單層細(xì)胞，將細(xì)胞分為六組，分別為細(xì)胞對(duì)照組（細(xì)胞維持液），病毒模型組（細(xì)胞維持液+HCMV），姜黃素大劑量組（細(xì)胞維持液+HCMV+姜黃素0.8 μg/mL）、中劑量組（細(xì)胞維持液+HCMV+姜黃素0.4 μg/mL）和小劑量組（細(xì)胞維持液+HCMV+姜黃素0.2 μg/mL）、更昔洛韋組（細(xì)胞維持液+HCMV+GCV 50 μg/mL），更昔洛韋為陽性對(duì)照藥。病毒感染滴度為100 TCID50/孔，細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)1 h后去棄去病毒液。將以上六組細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于感染早期（≤12 h）和感染晚期（≥48 h）收集細(xì)胞，依據(jù)試劑盒說明書操作，進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。實(shí)驗(yàn)過程至少進(jìn)行3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

將HELF細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)成單層細(xì)胞后，同步化培養(yǎng)12 h；約100 TCID50/孔病毒滴度感染細(xì)胞，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附1～2 h，棄上清；細(xì)胞對(duì)照組和病毒模型組更換維持液繼續(xù)培養(yǎng)；姜黃素各組終濃度分別為大劑量組（細(xì)胞維持液+HCMV+姜黃素0.8 μg/mL）、中劑量組（細(xì)胞維持液+HCMV+姜黃素0.4 μg/mL）和小劑量組（細(xì)胞維持液+HCMV+姜黃素0.2 μg/mL）；更昔洛韋組（細(xì)胞維持液+HCMV+GCV 50 μg/mL）。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于感染早期（≤12 h）和感染晚期（≥48 h）收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞制成單層細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，1000 r/min離心5 min，加入預(yù)冷的70%乙醇，于4℃固定過夜后，PBS洗滌，離心后去除固定液，加PI染色液（含50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.2% Triton X-100）置于4℃避光孵育30 min后即可進(jìn)行細(xì)胞周期分析。實(shí)驗(yàn)過程至少進(jìn)行3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t法和Dunnett-t法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡情況比較

HCMV感染早期，病毒模型組與細(xì)胞對(duì)照組的細(xì)胞凋亡情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與病毒模型組比較，更昔洛韋組和姜黃素大、中、小劑量組細(xì)胞凋亡明顯增加（P < 0.05）。HCMV感染晚期，與細(xì)胞對(duì)照組比較，病毒模型組細(xì)胞凋亡明顯增加（P < 0.05）；與病毒模型組比較，姜黃素大、中、小劑量組細(xì)胞凋亡均有不同程度降低，其中姜黃素大劑量組與病毒模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 不同感染時(shí)期各組細(xì)胞周期情況比較

在HCMV感染早期及晚期，與細(xì)胞對(duì)照組比較，病毒模型組S期細(xì)胞顯著增多（P < 0.01）；與病毒模型組比較，姜黃素大、中、小劑量組S期細(xì)胞均明顯減少，而更昔洛韋組S期細(xì)胞明顯增多，G0/G1期細(xì)胞明顯減少（P < 0.05）。見圖2～3、表1。

3 討論

HCMV感染機(jī)體后，感染的細(xì)胞一般都處于不同的細(xì)胞周期。如果HCMV感染了處于G0/G1期的細(xì)胞，則細(xì)胞只能進(jìn)入到G1/S期；如果HCMV感染了處于S期的細(xì)胞，則細(xì)胞會(huì)一直處于S期，表現(xiàn)為停滯狀態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的有絲分裂停止[7]。本研究結(jié)果顯示在HCMV感染早期，病毒模型組S期細(xì)胞較細(xì)胞對(duì)照組明顯增多，而處于G0/G1期的細(xì)胞較細(xì)胞對(duì)照組有所減少。隨著感染時(shí)間延長，宿主細(xì)胞均表現(xiàn)為G2/M期細(xì)胞有所減少。經(jīng)過姜黃素干預(yù)治療后，姜黃素各劑量組處于S期細(xì)胞均明顯少于病毒對(duì)照組，G0/G1期細(xì)胞均有所增多，細(xì)胞凋亡沒有增加。

HCMV感染機(jī)體后，機(jī)體細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞死亡后機(jī)體會(huì)清除這些細(xì)胞，這是機(jī)體抵抗病毒感染對(duì)機(jī)體造成損傷的一種機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)在HCMV感染初期，HCMV為了阻止機(jī)體細(xì)胞凋亡，會(huì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)某些蛋白以阻止細(xì)胞凋亡[8]，從而保證病毒復(fù)制增殖能夠順利進(jìn)行，病毒的這種適應(yīng)性為其持續(xù)感染創(chuàng)建了有利的環(huán)境。機(jī)體感染HCMV后，病毒可能是通過作用于一些調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的細(xì)胞因子從而造成細(xì)胞正常周期的改變，比如感染后使細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期蛋白E（cyclin E）的表達(dá)上調(diào)，使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKIs）活性均發(fā)生改變等[9]。有研究發(fā)現(xiàn)處于S期的二倍體纖維母細(xì)胞感染HCMV后細(xì)胞表現(xiàn)出周期停滯，并且還出現(xiàn)病理性有絲分裂[10]。Murphy等[11]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。Lunaldi等[12]研究證實(shí)抗HCMV抗體與內(nèi)皮細(xì)胞激活和凋亡有關(guān)的分子基因程序的表達(dá)有關(guān)，可以促進(jìn)熱休克蛋白60（HSP60）的釋放，這可能是抗HCMV抗體促凋亡的另一分子機(jī)制。黃晨等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HCMV可以導(dǎo)致人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并且使宿主細(xì)胞處于G1期的細(xì)胞減少，進(jìn)而推測HCMV感染可能促進(jìn)了G0/Gl期細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期，細(xì)胞最終表現(xiàn)為增殖。有研究者發(fā)現(xiàn)HCMV感染后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯增多，運(yùn)用更昔洛韋進(jìn)行治療后，Bcl-2含量明顯減少，并且HCMV引起的抗凋作用明顯下降[14]。在HCMV病毒感染晚期，病毒對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用解除，反而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，以便病毒釋放。細(xì)胞感染后HCMV可以潛伏于細(xì)胞中，造成免疫系統(tǒng)的長期激活，改變免疫狀態(tài)，從而引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生多種慢性炎癥性疾病[15-16]。HCMV感染機(jī)體后患者會(huì)表現(xiàn)出視網(wǎng)膜炎，用更昔洛韋治療此類患者后，視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞凋亡明顯受到抑制。Zhou等[17]發(fā)現(xiàn)，與感染前比較，感染HCMV的平滑肌細(xì)胞（SMCs）的增殖明顯提高。2005年，Reinhardt課題組[18]也得到了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)，HCMV感染SMCs后，細(xì)胞內(nèi)p53的含量減少，SMCs的凋亡受到抑制[19]。同時(shí)Epstein等[20]也證實(shí)了這一點(diǎn)，即HCMV可以調(diào)控SMCs p53的基因表達(dá)，從而減少SMCs細(xì)胞的凋亡。Liao等[21]研究結(jié)果進(jìn)一步表明HCMV感染可以影響內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的自然凋亡過程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有顯著抗HCMV的作用[22-23]，但具體機(jī)制不清。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠?qū)笻CMV感染引起的細(xì)胞凋亡作用，可使HCMV感染早期誘導(dǎo)的抗凋亡作用和HCMV感染晚期誘導(dǎo)的促凋亡作用減弱。

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（收稿日期：2018-04-24 本文編輯：羅喬荔）