轉谷氨酰胺酶對大豆蛋白凝膠特性及結構的影響

臧學麗，陳 光

(1 吉林農業(yè)大學 生命科學學院，吉林 長春 130118 ；2 長春醫(yī)學高等?？茖W校，吉林 長春 130031)

大豆是我國傳統(tǒng)的植物蛋白源食物[1]，具有使用范圍廣、制品種類多等特點[2]。大豆中蛋白質含量較高[3]，且必需氨基酸含量豐富[4]。大豆蛋白具有溶解性、凝膠性、乳化性等功能特性，添加到食品中可以提高食品的營養(yǎng)價值，改善食品的感官，具有降血脂、保護心血管及美容等功效[5]。但天然的大豆蛋白功能特性不突出，如形成凝膠的強度差等，難以滿足食品體系對大豆蛋白的需求，需要用一定的方法改善大豆蛋白的功能特性。目前，大豆蛋白改性的方法有物理法、酶法、化學法等。其中酶法改性大豆蛋白不但可以提高大豆蛋白的功能特性，還能提高其營養(yǎng)價值，被認為是一種理想的改性方法，成為人們研究的熱點。但目前酶法改性大豆分離蛋白的改性結果仍然不能滿足工業(yè)生產(chǎn)需要，如曲玲等[6]對大豆分離蛋白進行復合改性，改性后的大豆分離蛋白的凝膠性能雖然得到了提高，但提高效果并不顯著。酶法改性大豆蛋白過程極其復雜，大豆品質[7]及大豆蛋白凝固酶的種類[8]、作用時間[9]、作用溫度、添加量和pH等,均為影響大豆制品口感[10]、品質及外觀的重要因素[11]，改性過程中氨基酸的組成、比例、蛋白的空間結構均會發(fā)生很大變化，如何控制酶凝固過程，使改性后大豆蛋白的功能特性滿足人們的需求，是酶改性大豆蛋白的關鍵，但目前對該問題的研究尚顯薄弱。本研究從大豆蛋白和酶兩個方面進行分析，包括優(yōu)質大豆的選擇[12]及大豆蛋白凝固酶種類的選擇[13]等，利用響應面法優(yōu)化轉谷氨酰胺酶凝固大豆蛋白的最佳作用時間[14]、溫度、pH和酶添加量，旨在提高大豆蛋白的凝膠性，并對轉谷氨酰胺酶聚合大豆蛋白結構[15]的變化進行分析，以期為大豆蛋白的分離和大豆制品的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試大豆品種

大豆品種吉農 34、吉農 28、吉農18、吉農 17、吉農芽豆及北豆28，由吉林農業(yè)大學生命科學學院提供。

1.2 試驗用酶

堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶及轉谷氨酰胺酶，均購于Sigama。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備 以6種大豆粉碎的大豆粉為原料，經(jīng)石油醚脫脂制得脫脂大豆粉，然后采用堿提酸沉法[16]制備大豆分離蛋白。

1.3.2 6種大豆的蛋白質含量及凝膠強度分析 精選6種不同大豆，利用近紅外谷物分析儀對大豆蛋白質、脂肪及水分含量進行分析，并用上述4種凝固酶對6種大豆分離蛋白進行凝固反應，利用SMSTA.XTPlus質構儀測定大豆蛋白的凝膠強度，分析大豆蛋白質含量對大豆分離蛋白凝膠的影響。凝膠強度為破斷力與凹陷距離的乘積：凝膠強度(g·mm)=破斷力×凹陷距離。

1.3.3 4種酶對大豆分離蛋白凝固能力的比較 準確稱取7 g大豆分離蛋白，放入燒杯中，加入50 mL蒸餾水，充分攪拌均勻，使大豆分離蛋白達到均勻、穩(wěn)定狀態(tài)，在0.1 MPa、121 ℃高溫下蒸煮20 min，置室溫條件下冷卻。將冷卻后的大豆分離蛋白在40 ℃水浴1 h，然后分別加入轉谷氨酰胺酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，酶加入后迅速攪拌，使酶與大豆分離蛋白迅速混合, 1 h 后取出,放入冰水混合物中冷卻1 h，置于4 ℃冰箱保存，即得大豆蛋白凝膠，測定大豆蛋白的凝膠強度。同時以未添加酶的處理為空白對照。每組3個平行。

1.4 大豆分離蛋白凝膠強度的影響因素

1.4.1 反應時間 控制反應條件為反應溫度50 ℃，酶添加量36 U/g，pH 7.0，測定反應時間為1，2，3，4和5 h時大豆蛋白的凝膠強度。

1.4.2 反應溫度 控制反應條件為酶添加量36 U/g，pH 7.0，分別在30，40，50，60和70 ℃的溫度條件下反應2 h，測定大豆蛋白的凝膠強度。

1.4.3 酶添加量 控制反應條件為反應溫度50 ℃，pH 7.0，在轉谷氨酰胺酶添加量分別為24，30，36，42和48 U/g的條件下反應2 h，測定大豆蛋白的凝膠強度。

1.4.4 pH 控制反應條件為反應溫度50 ℃，酶添加量36 U/g，在pH分別為5.0，6.0，7.0，8.0和9.0的條件下反應2 h，測定大豆蛋白的凝膠強度。

1.5 高強度大豆分離蛋白凝膠制作工藝的響應面法優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，選取酶添加量(X1)、反應時間(X2)、反應溫度(X3)和pH(X4)作為自變量，以大豆分離蛋白的凝膠強度為因變量(Y)進行響應面(表1)分析，對大豆蛋白凝膠的最佳制作工藝條件[17]進行優(yōu)化。

表1 高強度大豆分離蛋白凝膠制作工藝響應面優(yōu)化試驗的因素及水平Table 1 The factors and levels of response surface methodology on preparation of high strength soybean protein isolate gel

1.6 加入轉谷氨酰胺酶前后大豆分離蛋白凝膠的掃描電鏡分析

取加入轉谷氨酰胺酶后制得的大豆蛋白及未加轉谷氨酰胺酶的大豆蛋白樣品各適量，5 000 r/min離心10 min，保留沉淀并均勻分散于體積分數(shù)4%的戊二醛中，4 ℃冰箱中過夜固定。取固定的沉淀用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，用體積分數(shù)30%，50%，70%，85%，95%的乙醇溶液逐級脫水，再用體積分數(shù)100%的乙醇脫水2次，每次脫水15 min。脫水后的樣品5 000 r/min離心10 min，收集沉淀，于真空冷凍干燥機中冷凍干燥，最后電鏡檢測。

1.7 大豆分離蛋白結構的圓二光譜分析

1.7.1 Near-UV CD光譜檢測 主要用于大豆分離蛋白的三級結構分析。稱取5 mg大豆分離蛋白樣品，溶于5 mL pH 7.2的5 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，室溫條件下攪拌25 min，8 000 r/min離心10 min,收集上清液,稀釋至1 mg/mL進行CD光譜檢測。圓二光譜的檢測波長為250～320 nm。

1.7.2 Fear-UV CD光譜檢測 主要用于大豆分離蛋白的二級結構分析。稱取5 mg大豆分離蛋白樣品，溶于5 mL pH 7.2的5 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，室溫條件下攪拌25 min，8 000 r/min離心10 min,收集上清液,稀釋至0.1 mg/mL進行CD光譜檢測。圓二光譜的檢測波長為190～250 nm。

2 結果與分析

2.1 6種大豆的蛋白質含量及凝膠強度

大豆分離蛋白的凝膠強度與大豆中所含的蛋白質含量密切相關。由表2可知，6種大豆的蛋白質含量均較高，其中吉農芽豆中的蛋白質含量最高，達到了383.9 g/kg。對圖1和表2進行對照分析得知，大豆蛋白含量與所形成凝膠的強度呈正相關性，蛋白質含量越高，凝膠強度值越大，吉農芽豆所形成的大豆蛋白凝膠強度最強，與理論上高蛋白有利于提高大豆分離蛋白的凝膠強度相一致[18]。所以在后續(xù)試驗中選擇吉農芽豆作為原材料。

表2 6種供試大豆主要成分的含量Table 2 Main components of six selected soybeans g/kg

2.2 4種蛋白酶對大豆分離蛋白凝固能力的影響

試驗觀察發(fā)現(xiàn)，未添加蛋白酶的對照組未形成大豆蛋白凝膠。由圖2可以看出，相較于對照，蛋白酶的加入使得大豆蛋白的凝膠強度得到了明顯提高，但每種蛋白酶對大豆分離蛋白的凝固能力也不盡相同，其中以轉谷氨酰胺酶對大豆分離蛋白凝固的影響作用最強，所以選擇轉谷氨酰胺酶進行后續(xù)試驗。

圖1 6種大豆分離蛋白凝膠強度的比較Fig.1 Comparison of six soy protein isolate gel strengths

圖2 不同蛋白酶對大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.2 Effect of different proteases on strength of soy protein isolate gel

2.3 大豆分離蛋白凝膠強度的影響因素

2.3.1 反應時間 由圖3可知，在反應時間小于2 h時，大豆蛋白的凝膠強度隨著反應時間的增加不斷增大，反應超過2 h后大豆蛋白的凝膠強度逐漸降低。因此確定大豆蛋白與轉谷氨酰胺酶的最佳反應時間為2 h。

2.3.2 反應溫度 由圖4可知，在反應溫度為50 ℃時，大豆蛋白的凝膠強度達到最高值。主要原因可能是在溫度較低的條件下轉谷氨酰胺酶的活性較低，因此大豆蛋白的凝聚程度較低；而溫度過高時，大豆蛋白的催化活性有所降低[19]。所以在其他反應條件確定時，大豆蛋白與轉谷氨酰胺酶的最佳反應溫度為50 ℃。

圖3 反應時間對大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.3 Effect of reaction time on strength of soy protein isolate gel

2.3.3 酶添加量 由圖5可以看出，在酶添加量為36 U/g時，大豆蛋白的凝膠強度達到最佳值。所以在其他反應條件確定時，大豆蛋白與轉谷氨酰胺酶反應時酶的最佳添加量為36 U/g。

2.3.4 pH 由圖6可以看出，在反應pH為7.0時，大豆蛋白的凝膠強度達到最大。原因可能是轉谷氨酰胺酶的最佳催化pH為7.0，pH過高或過低都會抑制轉谷氨酰胺酶的酶活[20]。

圖5 酶添加量對大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.5 Effect of enzyme concentration on strength of soy protein isolate gel

2.4 高強度大豆分離蛋白凝膠制作工藝的優(yōu)化

2.4.1 大豆分離蛋白凝膠制作工藝的響應面優(yōu)化 酶添加量(X1)、反應時間(X2)、反應溫度(X3)和pH(X4)對大豆分離蛋白凝膠強度(Y)影響的響應面試驗結果見表3。

表3 大豆分離蛋白凝膠制作工藝響應面試驗結果Table 3 Result of response surface on preparation of soy protein isolate gel

注：X1.酶添加量；X2.反應時間；X3.反應溫度；X4.pH;Y.凝膠強度。表4同。

Note:X1.Enzyme amount;X2.Reaction time;X3.Reaction temperature;X4.pH;Y.Gel strength.Table 4 is same.

根據(jù)表3試驗數(shù)據(jù)，對自變量X1(酶添加量)、X2(反應時間)、X3(反應溫度)和X4(pH)進行回歸分析，由Design-Expert 8.0.5.0擬合出二次多項回歸方程為：

表4 二次多項回歸模型的ANOVA分析Table 4 ANOVA analysis of quadratic multinomial regression model

注：*表示無顯著影響,P>0.05;**表示影響顯著,P<0.05；***表示影響極顯著,P<0.01。

Note：*Means insignificant,P>0.05;**Means significant,P<0.05；***Means extremely significant,P<0.01。

根據(jù)ANOVA分析可以看出，反應時間對大豆蛋白凝膠強度的影響最為顯著。由表4可知，失擬項的P值>0.05，差異不顯著，模型的F檢驗值為68.62，P檢驗值<0.000 1，差異性極顯著，說明該模型與實際試驗結果擬合較好，可用于對大豆蛋白凝膠強度的理論預測。

通過響應面法優(yōu)化可知，在酶添加量為34.67 U/g、反應時間為2.21 h、反應溫度為60 ℃及pH為7.22時，大豆蛋白的凝膠強度達到最大,為181.779 g·mm。

2.4.2 影響因素交互作用分析 1)轉谷氨酰胺酶添加量與反應時間的交互作用。由圖7可知，當轉谷氨酰胺酶的添加量和反應時間增大或減小時，大豆蛋白凝膠的凝膠強度隨之增大或減小，而當轉谷氨酰胺酶的酶添加量達到36 U/g左右，反應時間約為2 h時，大豆蛋白凝膠強度達到最高。超過此范圍，凝膠強度則下降。說明轉谷氨酰胺酶的添加量過高或反應時間過長都不適合大豆蛋白凝膠強度的增大[21]，故本試驗中轉谷氨酰胺酶添加量與反應時間的交互作用對大豆蛋白凝膠強度有極顯著的影響。

圖7 轉谷氨酰胺酶添加量與反應時間的交互作用對大豆蛋白凝膠強度影響的等高線圖及響應面圖Fig.7 Contour map and response surface map of soybean protein gel strength under the interaction between transglutaminase concentration and reaction time

2)轉谷氨酰胺酶添加量與反應溫度的交互作用。由圖8可知，在反應溫度一定的條件下，大豆蛋白的凝膠強度隨酶添加量增加先增大后減小，在酶添加量為36 U/g時達到最高值。而在酶添加量一定的條件下，大豆蛋白凝膠的凝膠強度隨反應溫度的變化略有不同。本試驗中轉谷氨酰胺酶的添加量與反應溫度的交互作用對大豆蛋白凝膠強度有極顯著影響。

圖8 轉谷氨酰胺酶添加量與反應溫度的交互作用對大豆蛋白凝膠強度影響的等高線圖及響應面圖Fig.8 Contour map and response surface map of soybean protein gel strength under the interaction between transglutaminase concentration and reaction temperature

2.5 轉谷氨酰胺酶對大豆蛋白凝膠結構的影響

由圖9和10可知，未添加轉谷氨酰胺酶的大豆蛋白凝膠內部結構非常松散(圖9)，而添加轉谷氨酰胺酶的大豆蛋白凝膠內部結構致密(圖10)，說明轉谷氨酰胺酶對大豆蛋白凝膠的內部結構或集團之間的相互作用有非常重要的調節(jié)作用[22]。

圖9 未加入轉谷氨酰胺酶的大豆蛋白凝膠的電鏡觀察 Fig.9 Electron microscope observation of soybean protein without addition of transglutaminase

2.6 大豆分離蛋白的圓二光譜

2.6.1 Near-UV CD分析 大豆分離蛋白經(jīng)過轉谷氨酰胺酶處理前后的近紫外CD分析結果見圖11，近紫外CD圖譜可明確顯示出大豆分離蛋白酶處理前后三級結構的變化。由圖11可以看出，大豆分離蛋白在265 nm處有紫外吸收峰。不同種類氨基酸的吸收峰值不同，Trp、Tyr及Phe 3種芳香族氨基酸的吸收峰值均在250～290 nm[23]，故本研究證實近紫外光譜的主要來源為芳香族氨基酸，經(jīng)過轉谷氨酰胺酶的處理，芳香族氨基酸所對應區(qū)域的光譜圖形狀橢圓率大幅降低。由此說明經(jīng)過轉谷氨酰胺酶處理后，芳香族氨基酸殘基更多地暴露出來，這與Lagrain等[24]的研究結果一致。

2.6.2 Far-UV CD分析 轉谷氨酰胺酶處理前后大豆蛋白二級結構的遠紫外CD分析結果見圖12。從圖12可以看出，大豆蛋白和轉谷氨酰胺酶處理大豆蛋白2種樣品的遠紫外CD圖在195及215 nm附近分別有1個正峰和1個負峰，這是高度有序的β類型結構的一種特征。

通過Reed擬合計算，得到2種樣品的二級結構組成，見表5。從表5可以看出，轉谷氨酰胺酶處理前后大豆蛋白的二級結構存在一定的差別，與未經(jīng)過酶處理的大豆蛋白相比，轉谷氨酰胺酶處理后的大豆蛋白有序度更高，無規(guī)則卷曲結構含量相對較低，而β折疊含量相對增加?？赡茉蚴墙?jīng)過轉谷氨酰胺酶處理的大豆蛋白疏水基團重新排列[25]，大豆蛋白聚集體結構發(fā)生了變化，形成了穩(wěn)定的β-折疊構造，從而使產(chǎn)品的凝膠強度得到了明顯改善。

圖11 轉谷氨酰胺酶處理前后大豆蛋白三級結構的近紫外光譜分析Fig.11 Near-ultraviolet spectrum of soybean protein/soybean protein with enzyme

圖12 轉谷氨酰胺酶處理前后大豆蛋白二級結構的遠紫外光譜分析Fig.12 Far-ultraviolet spectrum of soybean protein/soybean protein with enzyme

大豆蛋白 Soybeanprotein α-螺旋/%α-helixβ-折疊/%β-sheetβ-轉角/%β-turns無規(guī)則卷曲/%Randomcoil加酶Withenzyme18.3137.6425.1018.95未加酶Withoutenzyme17.5028.3520.0234.13

3 結 論

1)確定了大豆品種吉農芽豆高蛋白更有利于提高大豆分離蛋白的凝膠強度，轉谷氨酰胺酶為最佳的大豆蛋白凝固酶。

2) 響應面法優(yōu)化結果表明，在酶添加量為34.67 U/g、反應時間為2.21 h、反應溫度為60 ℃及pH為7.22時，大豆蛋白的凝膠強度達到最大值181.779 g·mm。

3)通過電子顯微鏡掃描發(fā)現(xiàn)，轉谷氨酰胺酶對大豆蛋白凝膠的內部結構或集團之間的相互作用有非常重要的調節(jié)作用。

4)CD圖譜分析表明，經(jīng)過轉谷氨酰胺酶作用，大豆蛋白聚基體結構發(fā)生了變化，形成了穩(wěn)定的β-折疊構造，從而使產(chǎn)品的凝膠強度得到明顯改善。

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