尚 柯,楊方威,李 俠*,張春暉,錢書意,孫 圳
中國是世界肉類產銷總量最多的國家,據國際肉類組織公布數據顯示,中國畜禽肉類生產總量約占世界的27%[1]。凍藏作為肉類最重要的貯藏方式,能有效抑制微生物生長繁殖、延長貨架期,是肉類產品進出口貿易和地區(qū)間流通的主要產品形態(tài)。然而,肉品在經冷凍、凍藏、解凍后汁液流失與品質劣變十分嚴重[2-4]。肉品的保水性是衡量肉品品質重要的指標之一,直接影響肉品的感官品質與食用品質[5]。我國冷凍肉解凍后汁液損失嚴重,給生產企業(yè)造成很大的經濟損失[6]。因此,探究提高肉品保水性的新型凍結解凍技術具有極其重要的意義。
目前,肉類凍結解凍技術主要有超高壓凍結解凍、電場凍結解凍、超聲波凍結解凍、磁場凍結、微波解凍和靜電場輔助凍結-解凍技術等[7],其中靜電場輔助凍結-解凍技術具有效率高、設備成本低、操作簡單等優(yōu)勢[8]。該技術有助于提高冷凍食品的解凍速率、降低汁液流失、使解凍后肉品溫度均勻、減少食品油脂酸化、抑制微生物生長、提高食品品質。靜電場技術最早被用于水果和蔬菜的保鮮[9-12],Bajgai等[13]運用高壓靜電場技術延長了水果保質期。Hsieh[14]、郭衍銀[15]等在胡蘿卜汁與冬棗的研究中得出相似結論,經高壓靜電場處理后蔬果的保質期長,新鮮度和營養(yǎng)價值得到提高。Zhao Ruiping等[16]認為靜電場輔助處理可以提高青西紅柿的抗氧化能力。也有學者先后在肉制品和水產品品質控制方面進行了研究。Hsieh等[17]發(fā)現,冷凍雞胸肉在高壓靜電場作用下,其解凍時間較對照組縮短,多種微生物指標低于對照組。孫芳等[18]的研究發(fā)現,與常規(guī)解凍相比,高壓靜電場技術可縮短凍結牛肉解凍時間,顯著降低解凍汁液流失。He Xiangli等[8]認為高壓靜電場對肉品嫩度及相關食用品質產生有益效果。Mousakhani-Ganjeh等[9]研究表明,靜電場能顯著提高冷凍魚塊解凍速率和揮發(fā)性鹽基氮。但高壓靜電場的輸出電壓通常高于3 000 V,存在一定的安全隱患,具有一定局限性,不能運用于大規(guī)模食品凍結與解凍[19-20]。
低壓靜電場(low voltage electrostatic field,LVEF)可產生2 500 V左右的空間電勢,影響食品內部細胞的生命活力、凍結及解凍速率,不僅較高壓靜電場作用安全、節(jié)能,并且能達到食品保鮮、延長食品貨架期的目的,已引起廣泛關注[21]。Uemura等[22]的研究發(fā)現LVEF可顯著減少豬肉的解凍時間。路立立[23]的研究中,同樣認為通過靜電場處理可提高豬肉凍結、解凍速率及解凍后嫩度。但是目前學者的研究主要集中在肉品品質變化方面,關于靜電場輔助凍結-解凍對于肉品蛋白質中水分遷移規(guī)律未知,對蛋白質理化特性的研究較少。為探究基于靜電場輔助凍結-解凍條件下肌肉水分分布規(guī)律,揭示蛋白質理化特性的變化,本實驗研究2 500 V LVEF環(huán)境下對牛肉保水性及蛋白理化特性的影響,為冷凍肉品質控制技術開發(fā)提供理論依據。
原料肉由北京御香苑畜牧有限公司提供,檢疫合格、質量約為400 kg的2 歲齡草原黃牛背最長?。˙oine Longissmus dorsi)。牛屠宰后經48 h吊掛風冷排酸,從6 頭情況相近的公牛胴體中分別取2 塊背最長肌,共12 塊肉樣,每塊約為5 cm×4 cm×4 cm,運回實驗室后4 ℃冷藏并進行后續(xù)實驗。
實驗所用常規(guī)試劑均為國產分析純。
電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;735型溫度儀 德國德圖儀器有限公司;BCDW-228冰箱、DW-86L386型立式超低溫保存箱 青島海爾股份有限公司;Kjeltec 2300微量凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司;Q200差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)儀 美國TA公司;Allegra X-12R冷凍離心機 美國Beckman Coulter有限公司;T6紫外分光光度計 北京普析通用有限公司;MesoMR23-060H-I低場核磁共振(low field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)分析及成像系統(tǒng) 上海紐邁電子科技有限公司;DENBA+鮮度保持電場裝置 日本AGUA商事株式會社。
1.3.1 樣品處理
本實驗所采用的LVEF裝置由靜電場發(fā)生裝置和放電板組成,放電板在冷藏庫內產生LVEF,形成負離子環(huán)境,物料不與放電板直接接觸,輸出電壓2 500 V、電流0.2 mA,即為LVEF。其原理是離子化的氣體在電場內移動,從而使帶電粒子再受電場作用,從一極向另一極進行定向移動,達到加工所需目的。
12 塊肉樣隨機平均分為4 組,分別為自然凍結-解凍(conventional freezing-conventional thawing,C-C)組(對照組)、LVEF輔助凍結-解凍(LVEF freezing-LVEF thawing,L-L)組、自然凍結-LVEF輔助解凍(conventional freezing-LVEF thawing,C-L)組、LVEF輔助凍結-自然解凍(LVEF freezing-conventional thawing,L-C)組。用透明聚乙烯膜包裝后在-18 ℃冰柜中進行凍結-解凍實驗,肉樣距離靜電板均為30 cm。
將溫度儀探頭插入樣品幾何中心記錄其中心溫度,每隔5 min記錄一次溫度。當肉樣中心溫度低至所設凍結溫度-18 ℃時,取出肉樣放置于4 ℃冰箱中進行解凍實驗,至中心溫度為1 ℃時視為解凍完全。
1.3.2 指標測定
1.3.2.1 凍結-解凍曲線繪制
樣品凍結解凍過程中,將溫度儀插入樣品幾何中心記錄其中心溫度,每隔5 min記錄一次溫度,繪制凍結-解凍曲線[24]。凍結、解凍速率v按照式(1)、(2)國際制冷協(xié)會提出的計算方法進行計算[25]。
式中:v1為凍結速率/(cm/h);δ1為凍結過程中樣品表面到熱中心最短距離/cm;t1為樣品表面達0 ℃至熱中心溫度達初始凍結點以下10 ℃所需的時間/h;v2為解凍速率/(cm/h);δ2為解凍過程中樣品表面與熱中心的最短距離/cm;t2為樣品表面達0 ℃至熱中心溫度達2 ℃所需的時間/h。
1.3.2.2 解凍汁液流失率測定
參照Honikel[26]的方法,準確稱量解凍前、后肉塊的質量,分別記為m1、m2,按照式(3)計算解凍汁液流失率。
1.3.2.3 肌原纖維蛋白表面疏水性測定
參照李銀等[27]的方法,從牛肉樣品中分離提取肌原纖維蛋白,再根據Chelh等[28]的方法,將肌原纖維蛋白懸浮液用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)調成2 mg/mL的溶液,取2 mL蛋白稀釋液并加入40 μL 1 mg/mL的溴酚藍溶液,充分混合。空白組為2 mL磷酸鹽緩沖液中直接加入40 μL 1 mg/mL溴酚藍溶液。將4 組樣品置于室溫條件下振蕩10 min,然后在4 ℃條件下4 000×g離心15 min。上清液在595 nm波長處測定吸光度。按照式(4)計算結合態(tài)溴酚藍質量,作為表面疏水性指數。
式中:A1為空白組吸光度;A2為樣品吸光度。
1.3.2.4 熱穩(wěn)定性分析
參考Deng等[29]的方法。準確稱取肉樣10~16 mg,立即密封于鋁盒中,放入DSC儀中測定,并以空鋁盒為空白對照,測定條件為:樣品于20 ℃平衡2 min,再以3 ℃/min的速率升到100 ℃;每個樣品平行測定3 次,結果取3 次平均值。再參照李俠等[24]的計算方法將所得蛋白質DSC熱流圖換算為蛋白質變性溫度和變性焓。
1.3.2.5 水分遷移程度分析
參照謝小雷等[30]的方法,采用磁共振成像技術(magnetic resonance imaging,MRI)測定牛肉H質子密度圖像,使用MesoMR23-060H-I LF-NMR分析及成像系統(tǒng),將實驗樣品放入永磁場中心位置的射頻線圈中心,進行成像實驗。主要參數為:重復時間2 000 ms,重復次數4 次,縱向弛豫時間20 ms;根據CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)脈沖序列測得的弛豫時間T2,選擇自旋回波時間20 ms。
本實驗中采用Microsoft Excel 2010軟件處理數據并繪制分析圖,除特殊說明外,指標測定均為3 次平行測定結果,表示為利用IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計分析軟件進行Duncan法多重比較及顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。
圖1 牛肉凍結-解凍過程中心溫度變化Fig. 1 Changes in internal temperature of beef during freezing and thawing process
圖1分別為4 個處理組肉樣的凍結和解凍曲線。凍結過程的溫度曲線趨勢大體相同,分為明顯下降、平緩下降、明顯下降3 個階段。凍結過程中,樣品內部80%以上水分都凍結成冰,釋放相變熱,溫度下降緩慢,曲線平緩,該冰晶帶的起始溫度點即為凍結點。自然凍結與LVEF輔助凍結樣品通過最大冰晶生成帶歷時分別為6.08 h和2.67 h,LVEF輔助凍結較自然凍結歷時縮短了3.41 h。
表1 不同處理條件牛肉凍結-解凍速率和凍結-解凍時間變化Table 1 Changes in freezing-thawing rate and freezing-thawing time of beef subjected to different treatments
如表1所示,C-C組所需凍結時間為26.210 h,L-L、C-L、L-C組所需凍結時間分別為9.920、25.420 h和10.000 h。C-C組所需解凍時間為22.710 h,L-L、C-L、L-C組所需解凍時間分別為13.790、18.960 h和15.330 h。L-L組肉樣凍結時間較對照組縮短16.290 h,解凍時間較對照組縮短8.920 h,可見LVEF處理的樣品所需凍結-解凍時間較對照組明顯縮短,可以有效提高牛肉凍結-解凍速率。
圖2 不同處理條件牛肉解凍汁液流失率(A)及蛋白質含量(B)Fig. 2 Drip loss (A) during thawing and protein content (B) in beef subjected to different treatments
冷凍肉在解凍過程中汁液流失嚴重,流失的汁液中含有可溶性蛋白質,使肉品的營養(yǎng)損失。由圖2A可知,4 組肉樣解凍汁液流失率分別為8.30%、4.19%、4.28%和6.58%。由圖2B可知,4 組肉樣流失汁液中蛋白質含量分別為10.61%、9.91%、8.95%和10.10%。C-C組肉樣解凍汁液流失率、流失汁液中蛋白質含量顯著高于其他3 組(P<0.05),L-L組肉樣解凍汁液流失最少。結合圖1可知,LVEF處理可使肉樣凍結過程中通過最大冰晶生成帶所用時間短,凍結與解凍速率快,有利于降低解凍過程中肉樣汁液流失,從而保持牛肉的營養(yǎng)和風味[31]。
蛋白質表面疏水性是表征與外界極性水環(huán)境相連的蛋白質表面疏水性基團數量的一個重要標志,其值越大則蛋白持水性越小,也預示著蛋白質的保水能力越弱,結合水和不易流動水越容易“態(tài)變”為自由水,解凍后汁液流失率也就越高。
圖3 不同處理條件牛肉蛋白質表面疏水性變化Fig. 3 Effect of different treatments on surface hydrophobicity of beef proteins
圖3分別為4 個處理組肉樣凍結-解凍過程蛋白質表面疏水性變化情況。C-C組與L-L、C-L、L-C組的肉樣在凍結過程中肌原纖維蛋白吸附結合態(tài)溴酚藍的質量分別為27.57、16.16、27.57 μg和16.16 μg。在解凍過程中肌原纖維蛋白吸附結合態(tài)溴酚藍的質量分別為13.14、9.45、4.37 μg和3.47 μg,各組間差異顯著(P<0.05)。蛋白質表面疏水性升高可能是蛋白質分子解折疊,使肽鏈斷裂或結構伸展,分子的內部疏水基團暴露。本實驗研究發(fā)現自然凍結-解凍處理的牛肉樣品中蛋白質表面疏水性最低,表明LVEF凍結或解凍處理均能有效抑制疏水基團的暴露,結合圖2可知,LVEF處理能夠延緩牛肉中蛋白在解凍過程中水合能力的下降,降低解凍汁液流失。
借助DSC記錄熱流量隨時間或溫度變化形成的曲線。就蛋白質體系而言,當提高到某個特定溫度時,蛋白質本身受熱發(fā)生轉變,使蛋白質發(fā)生熱解旋或凝聚,蛋白質之間、蛋白質與周圍溶劑之間的相互作用導致熱量差的產生,在DSC曲線上形成“波峰”或“波谷”,其對應的橫坐標表示熱轉變發(fā)生的溫度[32],從而體現蛋白質的變性程度。
表2 不同處理條件牛肉蛋白質DSC分析結果Table 2 DSC analysis of proteins in beef subjected to different treatments
研究表明,一個典型的肌肉DSC圖譜有3 個熱轉變區(qū)域;發(fā)生在54~58 ℃之間第1個熱吸收峰是由于主要由肌球蛋白受熱轉變而引起的,發(fā)生在65~67 ℃之間的熱吸收峰由膠原質和肌漿蛋白變性引起,出現在80~83 ℃之間的峰是由肌動蛋白變性所引起的[33-34]。因此,峰1~3分別代表肌球蛋白、肌漿蛋白和肌動蛋白熱穩(wěn)定性的變化情況。峰的頂點溫度為蛋白變性溫度,3 個區(qū)域的峰面積代表蛋白質的變性焓。本實驗測定的3 個峰的溫度范圍分別為40~56、60~64、77~80 ℃。變性溫度反映了蛋白質穩(wěn)定性,變性溫度越高,其穩(wěn)定性越高。變性焓反映了蛋白質變性的大小,其值越大,說明變性越小,抗變性能力越強[24]。
由表2可得,C-C組峰1、峰2熱變性溫度和變性焓顯著低于其他處理組(P<0.05),L-L組峰1的熱變性溫度、變性焓顯著高于其他處理組(P<0.05),各處理組峰3的熱變性溫度、變性焓之間無顯著性差異(P>0.05)。這表明LVEF處理使肉樣肌球蛋白、肌漿蛋白的穩(wěn)定性較高,有助于維持肉樣該蛋白的抗變性能力,且該蛋白的變性程度小于LVEF輔助凍結作用或LVEF輔助解凍作用(L-C組和C-L組)。
LF-NMR技術是通過測定質子在磁場中的弛豫特性來研究樣品中含水率、水分分布、遷移及其他相關品質,主要包括MRI和磁共振波譜分析(magnetic resonance spectroscopy,MRS)技術。通過LF-NMR技術測定H質子的橫向弛豫時間T2來表征肌肉中水分的變化規(guī)律[35]。H質子的弛豫時間與水分的流動性密切相關,在食品體系中,水分狀態(tài)的不同,都會使弛豫時間T2發(fā)生改變[36]。肌肉中不同活動狀態(tài)的水,包括結合水、不易流動水和自由水,分別用T21、T22、T23所對應的峰面積來表示各自的相對含量[37]。
表3 不同處理條件牛肉水分分布及組成Table 3 Moisture distribution and composition of beef subjected to different treatments
由表3可知,凍結過程C-C組不易流動水T22、自由水T23在NMR圖譜上信號較弱,相對含量較低,結合水T21相對含量達到97.100 0%,L-L組不易流動水T22未檢出,結合水T21相對含量大于對照組,自由水T23相對含量反之。解凍后,由于蛋白質復性及表面疏水性的降低,發(fā)生水分回吸現象,部分自由水態(tài)變?yōu)椴灰琢鲃铀?。對照組解凍后的牛肉中較易轉變?yōu)樽杂伤纬山鈨鰮p失,而L-L組肉樣中不易流動水相對比例較高,自由水相對含量為0.120 00%(P<0.05)。推測認為,LVEF處理影響了牛肉中不同活動狀態(tài)水的分布情況,使解凍后自由水含量顯著降低,從而解凍汁液損失降低。
利用MRI技術可以獲得肌肉中水、脂肪等成分的高分辨率H質子密度像,能直觀地表現出肌肉中水分的分布及遷移[38-39]。MRI偽彩圖像中亮度越強,表明H質子信號越強,該部分的含水率越高。
圖4 不同處理條件牛肉凍結-解凍過程H質子密度加權偽彩圖Fig. 4 Weighted pseudo color images of H proton density in beef during different freezing-thawing processes
如圖4所示,在凍結過程中,自然凍結肉樣H質子密度圖像顯示出零星的“亮點”,而LVEF輔助凍結處理的肉樣H質子密度圖像中的“亮點”幾乎檢測不到;解凍后,L-L組肉樣較多地呈現出紅褐色,說明該處理組含水率豐富,C-C、C-L、L-C組解凍后肉樣較多地呈現出藍色,紅褐色較少,說明該處理組汁液流失較嚴重。LVEF輔助凍結-解凍能有效降低汁液流失率。
LVEF輔助凍結-解凍處理能夠顯著縮短肉樣通過最大冰晶生成帶的時間和解凍時間,有效提高牛肉凍結-解凍速率,有助于維持肌原纖維蛋白的抗變性能力和熱穩(wěn)定性,提高解凍過程中蛋白水合能力,降低肌肉中的自由水含量,從而有效地減少牛肉解凍汁液流失率,提高肌肉保水性。
LVEF輔助凍結-解凍處理可提高肉與肉制品品質,LVEF不僅比高壓靜電場更安全、節(jié)能,并且同樣能達到食品保鮮、延長貨架期的目的。但LVEF對食品在凍結及解凍過程中的影響機制還需進一步研究。
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