基于NanoLC-Orbitrap技術(shù)測定六種不同栽培品種大豆中多肽Lunasin含量

高夢笛，孟獻(xiàn)斌，幸岑璨，張玥，鄧海騰，王鳳忠

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）（2.清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)檢測中心，北京 100084）

大豆(Glycine max( L ). Merr)是我國四大油料作物之一，具有非常高的營養(yǎng)價值。大豆中含有豐富的蛋白質(zhì)和多肽，其中露那辛（Lunasin）是最早由日本新瀉大學(xué)醫(yī)學(xué)部的研究小組從大豆中分離純化并鑒定出來的一種功能多肽，分子質(zhì)量為5.5 ku，由43個氨基酸組成，氨基酸序列為SKWQHQQDSCRKQLQ GVNLTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDD[1]。2005年Lunasin被美國加利福尼亞大學(xué)伯克利分校de Lumen研究小組成功克隆，發(fā)現(xiàn)Lunasin能破壞細(xì)胞有絲分裂并引起染色體破裂和細(xì)胞凋亡，具有抗腫瘤的功效[2]。2012年，Gakvez等[3]在肝臟細(xì)胞HepG2中發(fā)現(xiàn)Lunasin可能通過降低HMGCR的活性來降低膽固醇。

研究表明Lunasin具抗氧化、抗炎、抗癌及降低膽固醇等功效，被預(yù)測可作為預(yù)防癌癥和降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的藥物。由于Lunasin來源于天然植物大豆，安全性相對較高，幾乎沒有毒副作用且不良反應(yīng)少，使其可能成為保護(hù)心血管方面的一線藥物。

目前報(bào)道的對Lunasin的定量分析常采用依賴于抗體的方法，Jeong等[4,5]用Western Blot法研究了美國市售的部分大豆產(chǎn)品，包括脫脂豆奶粉、大豆分離蛋白Lunasin的含量；Gonzalez等[6]用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）研究發(fā)現(xiàn)美國產(chǎn)不同種大豆中Lunasin的含量不同，Ren等[7]用LC-MS的方法檢測了藜麥中含有Lunasin。Western Blot和ELISA檢測依賴于Lunasin抗體的特異性，若抗體將具有相同抗原決定簇的其它肽類誤認(rèn)為是Lunasin，則可能干擾測定結(jié)果。只采用傳統(tǒng)LC-MS測定Lunasin，樣品中的復(fù)雜基質(zhì)干擾嚴(yán)重目標(biāo)肽響應(yīng)較低[7]，影響質(zhì)譜測定的閾值、線性、準(zhǔn)確度，甚至?xí)霈F(xiàn)假陽性[8,9]。本研究嘗試采用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜Orbitrap Fusion系統(tǒng)來進(jìn)行檢測，該儀器可實(shí)現(xiàn)三種質(zhì)量分析器的共同協(xié)作，平行反應(yīng)監(jiān)視法（PRM）實(shí)現(xiàn)了對全部離子碎片的檢測，該方法可以顯著提高識別的多肽數(shù)量，能夠更好地排除背景干擾和假陽性。

我國大豆資源豐富、產(chǎn)區(qū)眾多，品種逾越千個，主要有三大大豆主產(chǎn)區(qū)[10,11]。黑河43大豆是東北春大豆區(qū)主栽大豆品種；黔豆7號大豆是云貴高原春夏大豆區(qū)主栽大豆品種，是適宜西南山區(qū)種植的豐產(chǎn)性好、穩(wěn)產(chǎn)性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)品種；徐豆14大豆、皖豆35大豆是黃淮海夏大豆區(qū)的主栽品種，具有高產(chǎn)、籽粒商品性優(yōu)良等特點(diǎn)；中黃系列大豆是近年來我國大面積推廣栽培的品種之一，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育且具有高蛋白、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)[12,13]。美國和韓國等國外大豆品種中的Lunasin含量多有研究，而國產(chǎn)大豆品種中Lunasin含量鮮有報(bào)道。因此有必要建立有效的方法通過不同品種的比較篩選出富含多肽Lunasin的最佳品種，為功能性食品的開發(fā)提供理論支撐。

本研究以六種國產(chǎn)大豆：中黃13大豆、中黃75大豆、徐豆14大豆、黑河43大豆、黔豆7號大豆、皖豆35大豆為實(shí)驗(yàn)材料，建立了分離提取并測定大豆多肽Lunasin的方法，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離降低了基質(zhì)干擾，用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜（NanoLC-Obitrap）平行反應(yīng)監(jiān)視法（PRM）對六種國產(chǎn)大豆中Lunasin含量進(jìn)行測定，本測定方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

黑河43大豆由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所提供；徐豆14大豆由徐州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；黔豆7號大豆由貴州省油料研究所提供；中黃13大豆、中黃75大豆由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.1.2 試劑

乙醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純)、三氟乙酸，美國賽默飛世爾科技公司；質(zhì)譜級碳酸氫氨，美國Sigma公司；質(zhì)譜級二硫蘇糖醇(DTT)，美國Sigma公司；胰蛋白酶（Trypsin），美國Promega公司；Mini-PROTEAN? TGX?預(yù)制膠，美國Bio-Rad公司；Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品，成都凱捷生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；Blue Plus? IV預(yù)染Protein Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

電子天平Y(jié)Q116-01，梅特勒-托利多公司；超速多功能粉碎機(jī)，浙江永康公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造公司；離心機(jī)(LYNX6000)，美國賽默飛世爾科技公司；ZLS-1真空離心濃縮儀，湖南赫西儀器裝備有限公司；電泳儀(JY600C)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；EASY-Spray column(50 μm×15 cm，2 μm)色譜柱，美國賽默飛世爾科技公司；納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜（EASY-nLC 1000-Orbitrap Fusion Tribrid），美國賽默飛世爾科技公司；配制試劑所用的水為經(jīng)美國密里博公司的Milli-QAdvantage超純水儀處理過的超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Lunasin的提取

Lunasin的提取：將六種大豆粉碎過60目篩，參考Krishnan等[14]人的提取方法并稍作改動，稱量中黃13大豆、中黃75大豆、徐豆14大豆、黑河43大豆、黔豆7號大豆、皖豆35大豆，各100 mg，每份分別加入1 mL超純水，1 mL 30%的乙醇。在37 ℃震蕩提取30 min，于4 ℃ 12000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上層清液。取上層清液加入20 μL 100 mM氯化鈣，混勻，靜置5 min，于4 ℃ 12000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，棄去上層清液，取下層風(fēng)干。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(SDS-PAGE)：將上述樣品用1ml 1X SDS loading buffer溶解后離心，取上清液移至干凈的EP管中，煮沸5 min，上樣量5 μL，用Bio-rad預(yù)制膠和垂直電泳槽，恒定電壓80 V電泳120 min，考馬斯亮藍(lán)染色后脫色。

切下對應(yīng)凝膠條帶，進(jìn)一步切碎成1 mm3小塊，轉(zhuǎn)移于EP管中，用乙腈和碳酸氫氨脫色，二硫蘇糖醇（DTT）還原二硫鍵，用胰蛋白酶（trypsin）酶解，37 ℃過夜處理，然后用10%的三氟乙酸終止酶解反應(yīng)，所得到的肽段用含0.1%的三氟乙酸的50%丙酮溶液提取兩次，然后將提取好的肽段用真空離心濃縮儀進(jìn)行濃縮，再用0.1%的甲酸超純水復(fù)溶，高速離心混勻，用于質(zhì)譜檢測。

1.2.2 Lunaisn標(biāo)準(zhǔn)品的配制

圖1 大豆提取物及Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品SDS-PAG電泳圖Fig.1 SDS-PAG electrophoresis of soybean extractsand lunaisn standard

Lunaisn標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精密稱取Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，配成20 mg/mL的高標(biāo)，并梯度稀釋為2000 mg/L，100 mg/L、500 mg/L、250 mg/L和125 mg/L。SDS-PAGE和酶解用同上1.2.1所述的條件進(jìn)行處理。

1.2.3 Lunasin的測定

用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜（NanoLC-Obitrap）平行反應(yīng)監(jiān)視法（PRM）測定六種大豆中Lunasin含量。

色譜條件：色譜柱：EASY-Spray column (50 μm×15 cm，2 μm)；柱溫：25 ℃；流速：300 nL/min；進(jìn)樣體積2 μL；A液：0.1%甲酸水溶液，B液：0.1%甲酸的乙腈溶液；洗脫程序如表1所示。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：平行反應(yīng)監(jiān)視法（PRM）；采用正離子模式，離子傳輸管溫度320 ℃；一級全掃描范圍為m/z 350～1550，自動增益控制(AGC)和離子注入時間(IT)分別設(shè)為2.0e5和50 ms；二級掃描(dd-MS2) AGC設(shè)為5.0e4，離子注入時間IT設(shè)為100 ms，碰撞能量為32 eV，對所有質(zhì)譜結(jié)果使用Proteome Discover（Vesion PD1.4）軟件在Uniprot/Swiss-prot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，得到最合適的鑒定結(jié)果。

表1 洗脫程序Table 1 Elution program

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆提取物及Lunasin電泳結(jié)果

恒定電壓80 V電泳120 min，以考馬斯亮藍(lán)G-250染色后脫色，以Marker及陽性對照Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品作為參照物，電泳結(jié)果見圖1。從大豆提取物及Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品電泳結(jié)果圖中可以看出，在2號陽性對照Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品條帶相應(yīng)的位置，3～8號都有條帶出現(xiàn)，可能是多肽Lunasin。六種大豆的提取物的電泳條帶樣式近似，但顏色深淺不同。

2.2 Lunasin含量的測定

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖和一級質(zhì)譜圖Fig.2 Total ion chromatogram and mass spectrogram of standard substance

2.2.1 Lunasin定量肽段的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

如圖2所示是酶解后的標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖和一級質(zhì)譜圖，從總離子流圖中可以看出，響應(yīng)最強(qiáng)的化合物保留時間為26.53～27.37 min的峰，一級質(zhì)譜圖顯示該峰對應(yīng)的質(zhì)荷比（m/z）是693.86377。用NCBI中大豆蛋白庫Blast檢索得QLQGVNLTPCEK是大豆中Lunasin的特異性肽段，是其氨基酸序列SKWQHQQDSCRKQLQGVNLTPCEKHIMEKIQGR GDDDDDDDDD中的一部分，符合胰蛋白酶酶切位點(diǎn)特征，實(shí)際檢測出來的m/z是693.86377（理論值693.85999，誤差5.81×10-6），誤差小于10×10-6，可以認(rèn)為是同一肽段。

我們用Lunasin酶解后的特征性肽段QLQGVNLTPCEK來進(jìn)行定量。如圖3所示是Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖，從圖中可以看出響應(yīng)最高的離子為y4+離子。因此，選擇肽段QLQGVNLTPCEK，母離子m/z為693.86377，特征子離子y4+m/z為533.24133，來進(jìn)行大豆中Lunasin的定量。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品二級質(zhì)譜圖Fig.3 Two stage mass spectrogram of standard substance

按照1.2.2中的方法，Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品為2000 mg/L、1000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L和125 mg/L系列稀釋溶液用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜（NanoLC-Obitrap），平行反應(yīng)監(jiān)視法（PRM）法依次進(jìn)行檢測。以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積對其濃度進(jìn)行線性回歸，質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7993552.01x-1264601495.50，R2=0.998，線性關(guān)系良好，適用于定量分析。

2.2.2 精密度及樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密度實(shí)驗(yàn)：取2.2.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以2 μL進(jìn)樣量連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得峰面積的RSD分別為0.21%。

回收率實(shí)驗(yàn)：樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)參照許高燕[15]的方法，取同一大豆樣品粉末2份各100 mg，一份作為對照，另一份加入0.2 mg Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2.3中方法提取并進(jìn)行NanoLC-Obitrap分析，重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PRM方法測定大豆中Lunasin含量，可操作性強(qiáng)，方法準(zhǔn)確可靠，回收率為81.00%，RSD為2.10%。結(jié)果顯示，本法具有較好的重復(fù)性與靈敏度，適用于定量分析。

2.2.3 六種國產(chǎn)栽培大豆中Lunasin含量測定

取中黃13大豆、中黃75大豆、徐豆14大豆、黑河43大豆、黔豆7號大豆、皖豆35大豆，各100 mg，按上述方法，用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜（NanoLC-Obitrap），平行反應(yīng)監(jiān)視法（PRM）法依次進(jìn)行檢測其中多肽Lunasin含量，具體結(jié)果見表2。

表2 六種國產(chǎn)栽培大豆中Lunasin含量Table 2 Lunasin content in six different cultivars of domestic soybeans

3 結(jié)論

本文利用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜（NanoLC-Obitrap）平行反應(yīng)監(jiān)視法（PRM）對六種國產(chǎn)大豆中Lunasin的含量進(jìn)行了測定。發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)的六種大豆中均含有Lunasin，皖豆35大豆中Lunasin含量最高，為4.66 mg/g；中黃13中含量為2.24 mg/g；中黃75中含量為3.35 mg/g；徐豆14中含量為2.59 mg/g；黔豆7號中含量為2.03 mg/g；黑河43號含量為2.87 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大豆中Lunasin含量豐富。

本研究以國產(chǎn)六種大豆為實(shí)驗(yàn)材料，建立了提取大豆多肽Lunasin的方法，采用SDS-PAGE分離的方法降低了基質(zhì)干擾，并采用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜（NanoLC-Obitrap）平行反應(yīng)監(jiān)視法（PRM）對大豆中Lunasin含量進(jìn)行測定。本測定方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好。為全面認(rèn)識不同品種大豆中Lunasin及優(yōu)質(zhì)蛋白和多肽，開展大豆品種營養(yǎng)評價奠定了必要的理論基礎(chǔ)。同時Lunasin作為大豆中目前發(fā)現(xiàn)的含量較高的多肽，通過該分析方法檢測多肽的含量，可以用于篩選富含Lunasin大豆的優(yōu)勢品種，或許可能作為大豆質(zhì)量評價的一個方法，為功能性食品的開發(fā)提供支撐。

[1] Lule V K, Garg S, Pophaly S D, et al. Potential health benefits of Lunasin: a multifaceted soy-derived bioactive peptide [J]. Journal of Food Science, 2015, 80(3): 485-494

[2] De Lumen B O. Lunasin: a cancer preventive soy peptide [J].Nutrition Reviews, 2005, 63(1): 16-21

[3] Galvez A F. Identification of Lunasin as the active component in soy protein responsible for reducing LDL cholesterol and risk of cardiovascular disease [J]. Circulation, 2012, 126(21):A10693

[4] Jeong H J, Jeong J B, Kim D S, et al. Inhibition of core histone acetylation by the cancer preventive peptide Lunasin[J]. Journal Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(3):632-637

[5] Park J H, Jeong H J, de Lumen B O. Contents and bioactivities of Lunasin, bowman-birk inhibitor, and isoflavones in soybean seed [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(20): 7686-7690

[6] Gonzalez de M, E Vasconez, M de Lumen B O, et al. Lunsin concerntration in different soybean gentoyprs, commercial soy protein, and isoflavone products [J]. Journal Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(19): 5882-5887

[7] Ren G, Zhu Y, Shi Z, et al. Detection of Lunasin in quinoa(Chenopodium quinoa Willd.) and the in vitro evaluation of its antioxidant and anti-inflammatory activities [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2017, 97(12): 4110-4116

[8] Nakurte I, Klavins K, Kirhnere I, et al. Discovery of Lunasin peptide in triticale (X Triticosecale Wittmack) [J]. Journal of Cereal Science, 2012, 56(2): 510-514

[9] Dinelli G, Bregola V, Bosi S, et al. Lunasin in wheat: a chemical and molecular study on its presence or absence [J].Food Chemistry, 2014, 151(4): 520-525

[10] 李莉峰.我國大豆加工利用發(fā)展研究[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備,2011,1(199):6-8

LI Li-feng, Research on the processing and utilization of soybeans in China [J]. Agricultural Science & Technology and Equipment, 2011, 1(199): 6-8

[11] 趙力超,陳永泉,金越.我國大豆加工利用研究的綜合分析[J].現(xiàn)代食品科技,2015,21(1):157-159

ZHAO Li-chao, CHEN Yong-quan, JIN Yue. Analysis of Chinese soybean processing and utilization [J]. Modern Food Science and Technology, 2005, 21(1): 157-159

[12] 韓德志,閆洪睿,梁吉利,等.黑河43號大豆品種大面積推廣分析[J].中國西部科技,2013,11:55-56

HAN De-zhi, YAN Hong-rui, LIANG Ji-li. Heihe 43 soybean large extension analysis [J]. Science and Technology of West China, 2013, 11: 55-56

[13] 成雪峰,張鳳云.黃淮海夏大豆生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展對策[J].大豆科學(xué),2010,29(1):157-160

CHENG Xue-feng, ZHANG Feng-yun. Prensent conditions and countermeasures of soybean production in huang-huai-hai region [J]. Soybean Science, 2010, 29(1):157-160

[14] Krishnan H B, Wang T T. An effective and simple procedure to isolate abundant quantities of biologically active chemopreventive Lunasin Protease Inhibitor Concentrate(LPIC) from soybean [J]. Food Chemistry, 2015, 177:120-126

[15] 許高燕,劉瑩雯,銀董紅.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水溶性迷迭香提取物中迷迭香酸、阿魏酸和咖啡酸的含量[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2006,229(1):567-569

XU Gao-yan, LIU Ying-wen, YIN Dong-hong. Simultaneous determination of rosmarinic acid, caffeic acid and ferulic acid in water- soluble extract of rosemary by LC/MS/MS [J].Journal of Analytical Science, 2006, 22(5): 567-569