邢維新 田振軍

摘 要： 目的：探討運動訓練誘導大鼠心肌HGF和TGF-β1表達及其對心肌細胞增殖的影響。方法：30只3月齡SD雄性大鼠隨機分為安靜對照組、有氧運動組和大強度運動組，每組10只。安靜對照組大鼠不運動，有氧運動以15 m/min開始，遞增速度為3 m/min、時間為5 min，運動至速度20 m/min，增加跑臺坡度為5%，運動總時間為60 min，每周訓練5天。大強度運動以15 m/min開始，遞增速度為3 m/min、時間為10 min，運動至速度35 m/min，增加跑臺坡度為10%，運動總時間為90 min，每周訓練6天，各組訓練時間均為8周。訓練結束后進行HE染色觀察、血流動力學和心電圖測定，免疫組化和免疫熒光檢測大鼠心肌PCNA、Ki-67、HGF和TGF-β1的表達。結果：與安靜對照組相比，有氧訓練組大鼠心系數、LVSP、±dp /dtmax和T波電壓均有顯著性升高（P<0.05），LVEDP和心率均顯著下降（P<0.05），雙核細胞出現率增加，心肌組織中Ki-67、PCNA 、HGF和TGF-β1的MOD值均顯著升高（P<0.05），Ki-67和PCNA陽性細胞數量增多;大強度訓練組大鼠心系數、心率、LVED和PQT間期均顯著性升高（P<0.05），LVSP和±dp /dtmax均顯著下降（P<0.05），心肌組織中Ki-67和PCNA和HGF的MOD值下降，其中HGF的下降顯著（P<0.05），TGF-β1的MOD值則顯著升高（P<0.01）。結論：有氧運動大鼠心肌組織Ki-67和PCNA的表達升高，Ki-67和PCNA陽性細胞數量增多，心肌細胞增殖，有氧運動上調HGF和TGF-β1的表達可能促進心肌細胞增殖的發(fā)生;大強度運動可使心肌組織中Ki-67和PCNA的表達降低，心肌細胞增殖抑制;心肌細胞增殖可能是有氧運動提高心臟功能的一個重要機制。

關鍵詞： 運動訓練;大鼠;心功能;心肌細胞增殖

中圖分類號：G804.2?? 文獻標識碼：A? 文章編號：1006-2076（2018）06-0084-07

Abstract： Objective：To explore the effect of exercise training on the expression of HGF and TGF-β1 and its effect on the cardiomyocytes proliferation in rats. Methods：30 rats at the age of SD 3 months were divided into 3 groups in random way as normal control group， aerobic sports group and high-intensity training group， with 10 rats each group. Rats in normal control group did not exercise，

The rats in aerobic sports group do exercise at the speed of 15m/min， and then add speed at the rate of 3m/min for 5min， when the speed is 20m/min，5% of the running platform Gradient will be increased，After the rats in aerobic sports group do exercise for Total 60min， and they do training for 5 days per week;The rats in in high-intensity training group do exercise at the speed of 15m/min， and then add speed at the rate of 3m/min for 10 min， when the speed is 35m/min，10% of the running platform Gradient will be increased，After the rats in aerobic sports group do exercise for Total 90min， and they do training for 6 days per week;After the training for each group HE dyeing observation and determination of cardiac function by Hemodynamic and electrocardiogram， the expressions of PCNA， Ki-67， HGF， TGF-β1 in the myocardial tissue of rats have been checked by the way of immunohistochemistry and immunofluorescence. Results：Compared with normal control group， the heart coefficient， LVSP， ±dp/dtmax and T wave voltage of the rats from aerobic sports group have increased dramatically （P<0.05）， while both LVEDP and HR decreased greatly （P<0.05）; There is an increase of occurrence rate of binucleated cell， and MOD of Ki-67， PCNA， HGF and TGB-β1 in the myocardial tissue of rats was rising dramatically （P<0.05）; the number of Ki-67 and PCNA positive cells increased; Meanwhile， the heart coefficient， LVEDP and PQT interphase of the rats in high-intensity group rose dramatically （P<0.05） while their LVSP and ±dp /dtmax decreased greatly （P<0.05）， The MOD of Ki-67， PCNA， HGF decreased in high-intensity group rats， with HGF dropping greatly （P<0.05）; But the MOD of TGB-β1 rose dramatically （P<0.05）. Conclusions：The expression of Ki-67 and PCNA increased， the proliferation of myocardial cell improved， and the number of Ki-67 and PCNA positive cells increased in myocardial tissue of the rats of aerobic exercise group. The increase of HGF and TGB-β1 induced by aerobic exercise may promote the occurrence of the cardiomyocytes proliferation. While the high-intensity exercise can decrease the expression of Ki-67 and PCNA， and inhibit the proliferation of myocardial cell. Myocardial proliferation may be an important mechanism for aerobic exercise to improve heart function.

Key words： exercise training; rats; cardiac function; cardiomyocyte proliferation

傳統(tǒng)觀點認為，成熟的心肌細胞不能進行分裂，沒有增殖能力。然而，心肌細胞可發(fā)生凋亡已成為一個不爭的事實，從維護心臟完整的角度推測心肌中必然存在著細胞增殖。2000年以來，隨著科學研究方法的進步和研究技術的改進，心肌細胞具有分裂增殖能力的證據越來越多。Kajstura等研究發(fā)現，從出生到衰老，大鼠心臟中有相當比例的心肌細胞不斷在進行著分裂，以補充由于老化而引起的哺乳動物心肌細胞的不斷死亡[1]。隨后諸多學者證實在人、大鼠和小鼠的心臟中均存在著細胞的增殖[2-7]，心肌細胞增殖可作為心臟損傷后修復再生的基礎[5，8]。

近年來，有關運動與心肌細胞增殖的相關研究引起了國內外廣大學者的關注，相繼已有文獻報道。Waring CD等應用Western Blotting研究表明，有氧運動可使成人心臟心肌細胞Ki-67和Brdu表達顯著提高[9]。田振軍等應用Western Blotting研究表明，有氧運動可使大鼠心肌細胞PCNA的表達顯著升高[10]。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor， HGF）是一種多功能的細胞因子，可促進細胞增殖、遷移和形態(tài)發(fā)生[11]，對心梗心肌細胞增殖具有促進作用[12-13]。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）可參與細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等[14]，TGF-β1的高表達可刺激胚胎的心肌細胞分化[9]。目前，運動訓練對心肌HGF、TGF-β1表達的影響及其在心肌細胞增殖中的作用尚缺乏全面的文獻報道。本文采用免疫組織化學與免疫熒光等研究方法探討運動訓練對心肌細胞增殖因子PCNA、Ki-67及細胞生長因子HGF、TGF-β1表達的影響，并探討HGF、TGF-β1在心肌細胞增殖中的作用，為運動性心臟肥大的機制研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 體重180～220 g的Sprague Dawley 3月齡雄性大鼠30只，購于西安交通大學醫(yī)學院實驗動物管理中心。1周適應性喂養(yǎng)后，隨機分為安靜對照組、有氧運動組和大強度運動組，每組10只，均按嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲水、進食，分每籠5只飼養(yǎng)。大鼠在飼養(yǎng)和訓練過程中，安靜對照組存活10只，有氧運動組死亡1只，大強度運動組大鼠死亡2只。

1.2 大鼠運動訓練方案 安靜對照組大鼠不運動，正?；\內生活。有氧運動組和大強度運動組的運動負荷參照Bedford標準并略加改動[15]。有氧運動以15 m/min開始，遞增速度為3 m/min、時間為5 min，運動至速度20 m/min，增加跑臺坡度為5%，運動總時間為60 min，每周訓練5天。大強度運動以15 m/min開始，遞增速度為3 m/min、時間為10 min，運動至速度35 m/min，增加跑臺坡度為10%，運動總時間為90 min，每周訓練6天，各組訓練時間均為8周。大鼠訓練過程中用小于1 mV的電刺激強迫進行。

1.3 心電圖與血流動力學指標測定 8周訓練結束后，次日早晨大鼠腹腔麻醉，心電圖檢測，主要指標有HR、QRS波群間期、QT間期、T波電壓等參數。RM-6240多導生理記錄儀測量左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室內壓最大上升速率（+dp/dtmax） 和左心室內壓最大下降速率（-dp/dtmax）等血流動力學參數。

1.4 取材與樣品制備 大鼠心電圖和血流動力學測定結束后，迅速取出心臟，生理鹽水沖洗，濾紙吸干稱重，10%的中性甲醛溶液固定。常規(guī)酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟和石蠟包埋，以5 μm厚度連續(xù)切片用于HE染色、免疫組織化學和免疫熒光實驗樣品。

1.5 免疫組織化學與免疫熒光實驗 免疫組織化學實驗方案：采用SABC法，嚴格按試劑盒說明書操作步驟進行。取2套切片用去離子水沖洗，3%H2O2封閉。抗原修復：Ki-67、PCNA、HGF和TGF-β1微波修復，PBS沖洗;滴加正常山羊血清20min。滴加一抗： Ki-67、PCNA、HGF和TGF-β1抗體濃度為1[KG-*3]∶[KG-*3]70，4℃過夜，PBS沖洗;滴加二抗37℃ 20 min，PBS沖洗;滴加SABC 20 min，Tween+PBS混合液沖洗2 h;DAB顯色，蒸餾水沖洗;中性樹膠封片。染色設置陰性對照，即PBS代替一抗，其他程序同上。

免疫熒光實驗方案：連續(xù)切片嚴格按試劑盒說明書操作步驟進行，切片常規(guī)脫蠟至水。抗原修復：Ki-67、PCNA微波修復20 min，PBS沖洗;正常山羊血清封閉，37℃，45 min。滴加一抗：Ki-67、PCNA、α-肌動蛋白抗體濃度為1[KG-*3]∶[KG-*3]200，4 ℃過夜，Tween+PBS混合液沖洗沖洗30 min，PBS洗3次，每次10 min。滴加二抗（避光）：抗體濃度比為1[KG-*3]∶[KG-*3]50，4 ℃，24 h，Tween+PBS混合液沖洗沖洗30 min，PBS洗10 min×3次（免疫熒光雙標再滴加一抗和二抗，步驟同上），甘油磷酸緩沖液封片。染色設置陽性對照、陰性對照和自發(fā)熒光對照，分別用陽性血清、正常血清和PBS代替一抗。

1.6 數據處理與分析 免疫組織化學實驗結果用Olympus光學顯微鏡高、低倍結合觀察拍照，再用Image-Pro Plus6.0軟件采集數據，計算平均光密度值（MOD）。運用SPSS18.0 for Windows軟件包進行統(tǒng)計學處理，統(tǒng)計學方法采用One-Way ANOVA，結果以均數±標準差（[AKX-]±SD）表示。顯著性差異選擇P<0.05和P<0.01水平。免疫熒光化學圖像采用高、低倍結合，整體采集，局部放大，Leica TCS SP5激光共聚焦掃描顯微鏡拍片。

2 實驗結果

2.1 大鼠體重、心臟重量及心系數的變化

實驗結果顯示，與安靜對照組相比，有氧運動組大鼠體重顯著降低（P<0.05）、心臟重量明顯增加（P<0.01）、心系數顯著升高（P<0.05）;大強度運動組大鼠體重顯著下降（P<0.01）、心臟重量明顯增加（P<0.05）、心系數顯著升高（P<0.05），綜上所述，有氧訓練和大強度運動均可使大鼠心臟發(fā)生肥大（見表1）。

2.2 大鼠血流動力學指標和心電圖的變化

2.2.1 大鼠血流動力學指標的變化

實驗結果顯示， 與安靜對照組相比，有氧訓練組大鼠LVSP和±dp /dtmax均有顯著性升高（P<0.05），LVEDP顯著下降（P<0.05），表明有氧運動可顯著提高大鼠心臟的功能;大強度訓練組大鼠LVSP和±dp /dtmax均顯著下降（P<0.05）， LVEDP則顯著性升高（P<0.05），表明大強度運動可使大鼠心臟功能下降（見表2）。

2.2.2 大鼠心電圖的變化

實驗結果顯示，與安靜對照組相比，有氧訓練大鼠心率顯著下降，T波電壓顯著升高（P<0.05），QRS波群間期和QT間期無顯著變化，表明心臟功能增強;疲勞運動大鼠心率和QT間期顯著提高（P<0.05），QRS波群間期和T波電壓無顯著變化，表明心肌收縮時間延長，心功能下降（見表3）。

2.3 HE染色觀察結果

HE染色結果顯示，安靜對照組大鼠心肌細胞排列緊密整齊，胞漿呈紅色，細胞核呈藍色，區(qū)分明顯，偶見雙核心肌細胞出現;有氧運動大鼠心肌纖維結構清晰，肌纖維和細胞核大小勻稱，排列較安靜對照大鼠更緊密整齊，染色均勻，雙核細胞出現率高于對照組;大強度運動組大鼠心肌細胞肥大、混濁腫脹，肌纖維間隙增大，心肌纖維排列較有氧運動和安靜對照大鼠松散紊亂，細胞間界限模糊，有部分肌纖維斷裂，并在心肌細胞周圍可見大量紅細胞，雙核細胞出現率與安靜對照組差異不明顯（見圖1）。

2.4 大鼠心肌組織Ki-67、PCNA、 HGF和TGF-β1的免疫組化結果

在光學顯微鏡下可見，Ki-67、PCNA、 HGF和TGF-β1在各組大鼠心肌中均有表達，Ki-67、PCNA和HGF在心肌細胞中的表達見于細胞核中，TGF-β1主要表達于心肌細胞漿。與安靜對照組相比，有氧運動可使大鼠心肌組織中Ki-67、PCNA 、HGF和TGF-β1的MOD值均顯著升高（P<0.05），分別升高了18.8%、22.2%、10.8%和13.0%。大強度運動則使大鼠心肌組織中Ki-67和PCNA和HGF的MOD值下降，其中HGF的下降顯著（P<0.05），分別下降了6.3%、5.6%、10.8%，TGF-β1的MOD值顯著升高，升高了34.8%（P<0.01（見表4和圖2）。

2.5 大鼠心肌組織Ki-67、PCNA的免疫熒光結果

激光共聚焦掃描顯微鏡下，α-actinin標記為紅色，Ki-67標記為綠色，淡黃色表示心肌細胞核中Ki-67表達。在正常心肌組織中，淡黃色或黃綠色細胞很少，偶見心肌細胞核有表達，表明Ki-67陽性細胞數量很少;與安靜對照組比較，有氧運動組大鼠心肌細胞淡黃色或黃綠色明顯增多，表明有氧運動可使大鼠心肌Ki-67陽性細胞數量明顯增多;大強度運動組大鼠淡黃色或黃綠色很少，偶見心肌細胞核有表達，Ki-67陽性細胞數量變化不顯著。α-actinin標記為綠色，亮綠色標記PCNA。正常心肌組織中，心肌細胞核偶有亮綠色出現，表明正常心肌組織中PCNA陽性細胞數量很少;有氧運動大鼠亮綠色明顯增多，且主要在心肌細胞核上，表明有氧運動可使大鼠心肌PCNA陽性細胞數量明顯增多;疲勞運動大鼠亮綠色出現與安靜對照組差異不明顯，PCNA陽性細胞數量變化不顯著（見圖3）。

3 分析與討論

3.1 運動訓練可對大鼠心肌組織結構和心功能產生影響

業(yè)已證實，有氧運動可使心臟的形態(tài)結構產生良性影響，提升心臟的功能，大強度運動則產生相反的結果。本研究通過HE染色、血流動力學指標及心電圖測試結果表明，有氧運動可使大鼠心肌纖維排列較安靜對照組大鼠更緊密整齊，染色均勻，雙核細胞出現率高于安靜對照組，同時心系數、LVSP和±dp /dtmax及 T波電壓均顯著性升高，LVEDP和HR均顯著下降，表明有氧運動使大鼠心臟結構產生良性影響，心肌細胞產生適應性肥大，心率減慢，心輸出量增加，心功能顯著提高;大強度運動使大鼠心肌纖維排列較有氧運動和安靜對照大鼠松散紊亂，細胞間界限模糊，有部分肌纖維斷裂，心系數、LVEDP和QT間期均顯著性升高，LVSP和±dp /dtmax均顯著下降，表明大強度運動使大鼠心臟形態(tài)結構產生不良影響，心率加快，心肌收縮時間延長，傳導延遲或阻滯，心功能降低。

3.2 運動訓練可對大鼠心肌細胞雙核出現率產生影響

1996年Olivetti G等研究表明，人的心肌細胞有的是單核，有的是雙核，一般單核約占74%，雙核約占25.5%，這一比例不隨年齡、心臟肥大和缺血性心肌病而改變[16]。Bergmann和Kajstura等研究則認為，人在生長過程中，心肌細胞會緩慢更新，且隨年齡下降[5，17]。另有文獻報道，山羊出生后超過50%的心肌細胞進行著胞核分裂，隨著生長發(fā)育，單核細胞總數開始下降，雙核細胞數量迅速增加[18]。本研究表明，與安靜對照組相比，有氧訓練組大鼠雙核細胞出現率增加，表明有氧運動可使大鼠心肌細胞增殖的細胞核分裂顯著增加。大強度運動組大鼠則沒有差異。

3.3 運動訓練可對大鼠心肌組織PCNA和Ki-67表達產生影響

近年來，心肌細胞增殖研究成為了基礎醫(yī)學、生命科學和體育科學研究領域的一個重大熱點問題，研究內容主要集中在不同狀態(tài)下心肌細胞增殖因子（PCNA、Ki-67和Brdu等）的表達。

Ki-67抗原是存在于增殖細胞核的一種非組蛋白性核對蛋白，由345kd和395kd的兩條多肽鏈組成，與細胞增殖關系密切。研究認為，Ki-67可評估細胞的增生程度，是目前較為肯定的核增殖標志基因[19]。PCNA是DNA 復制合成過程中的一種必需的物質，并在DNA的修復過程中發(fā)揮重要作用。檢測PCNA是心肌細胞分裂增殖研究中一個常用的方法[20]。1998年以來，心肌細胞的增殖研究引起了國內外學者的高度重視。Beltrami 等用心肌肌動蛋白抗體顯示心肌細胞，Ki-67作為細胞增殖的標志，在心肌梗死邊緣區(qū)和遠距離區(qū)每百萬個心肌細胞分別檢出800個及300個Ki-67 陽性細胞[21]。Quaini 等在研究中發(fā)現，心肌梗死患者左心室心肌細胞PCNA 陽性率高達49%±19%，而其他相關報道多在10%以下[22]。綜上可見，有關心肌細胞增殖的研究一直以來主要集中在心肌梗死的心臟。

近年來，運動與心肌細胞增殖研究亦成為了體育科學、生命科學與基礎醫(yī)學等研究領域的一個重大課題，引起了國內外相關專家學者的關注。目前，有關運動促進心肌細胞增殖因子表達的研究已有文獻報道。Waring等研究表明，與安靜組相比，4周跑臺運動訓練可使大鼠左心室表達Brdu、ki-67 的心肌細胞增加，增加的百分比分別為7.2±1.3%和1.9±0.7%[23]。田振軍等學者運用Western Blotting證實，有氧運動可使大鼠心肌細胞PCNA的表達顯著升高[10]。本研究免疫組織化學結果表明， 與安靜對照組相比，有氧運動大鼠心肌組織Ki-67、PCNA分別升高了18.8%、22.2%，提示有氧運動可使大鼠心肌組織Ki-67、PCNA的表達顯著升高。大強度運動則可使大鼠心肌組織中Ki-67和PCNA的表達分別下降了6.3%、5.6%，差異不顯著。免疫熒光結果顯示，在正常心肌組織中，Ki-67、PCNA陽性細胞數量很少;有氧運動可使Ki-67、PCNA陽性細胞數量明顯增多;大強度運動組大鼠Ki-67、PCNA陽性細胞數量變化不顯著。綜上可見，有氧運動可促進大鼠心肌細胞增殖，大強度運動則抑制大鼠心肌細胞的增殖。

3.4 運動訓練誘導大鼠心肌HGF 和TGF-β1表達影響心肌細胞增殖

近年來，心肌細胞增殖及其誘導因素的相關研究引起了眾多專家學者的關注。目前認為，HGF和TGF-β1等多種細胞生長因子參與了心肌細胞增殖的過程。HGF是由一條含有728個氨基酸的單鏈前體蛋白裂解而來的異質二聚體。研究發(fā)現，HGF 是一種多功能的細胞因子，它具有促細胞增殖、遷移和形態(tài)發(fā)生，在胚胎生長、組織形成和組織器官修復中起重要作用[11]。TGF-β是一組對細胞生長、分化等起調節(jié)作用的細胞因子超家族，有三種亞型即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。研究發(fā)現，TGF-β1可參與細胞增殖、分化、抑制炎癥、促進血管新生、引起心肌細胞肥大、纖維化 [14]。

目前，有關運動對心肌細胞生長因子HGF和TGF-β1表達的影響及其在心肌細胞增殖中的作用研究文獻報道尚缺。本研究結果顯示，有氧運動可使大鼠心肌組織中HGF和TGF-β1的表達顯著升高，大強度運動則可使大鼠心肌組織中HGF的表達顯著降低，TGF-β1的表達過度升高。前文報道，有氧運動可以使心肌組織中PCNA、Ki-67的表達顯著升高，Ki-67、PCNA陽性細胞數量明顯增多，心肌細胞趨于增殖，而大強度運動則可使心肌組織中PCNA、Ki-67的表達下降，心肌細胞增殖抑制。研究表明，HGF可通過p27途徑促進心肌梗死后心肌細胞增殖，其下游途徑與心肌細胞周期蛋白CyclinA/cdk2、CyclinE/cdk2和CyclinD1/cdk4有關[13]。因此推測，有氧運動上調HGF的表達促進心肌細胞增殖，其機制可能為HGF通過p27途徑，與下游CyclinA、CyclinE、CyclinD1與cdk4等細胞周期蛋白的表達有關;大強度運動使HGF的表達降低則可能抑制了心肌細胞增殖的發(fā)生。TGF-β1對細胞的增殖作用可表現出促進或抑制作用，一般認為，低濃度的TGF- β1促進細胞增生，而高濃度時則抑制細胞增生。陳章煒等研究表明，新生大鼠心肌細胞的增殖可能與TGF-β1表達增高有關[24]。另有研究表明，TGF-β1的高表達可刺激胚胎的心肌細胞分化[9]。由此推測，TGF-β1參與了大鼠心肌細胞的增殖，有氧運動使TGF-β1表達升高可能促進心肌細胞增殖的發(fā)生;大強度運動誘導TGF-β1的過度表達則會抑制心肌細胞的增殖。近年來，有關心肌細胞增殖的細胞信號轉導通路已有相關文獻報道。Bersell K等研究表明，心肌細胞能夠被NRG1/ErbB4信號誘導激活，發(fā)生心肌細胞增殖，促進心肌再生和提升心功能[25]。另有研究表明，運動訓練調節(jié)NRG1表達并激活ErbB2和ErbB4 PI3K/Akt信號轉導通路，通過促進內源性心肌再生修復心臟[26]。有氧運動上調HGF和TGF-β1表達促進心肌細胞增殖的細胞信號轉導通路研究仍有待于今后深入研究。

本研究表明，有氧運動可使大鼠心肌產生適應性肥大，心肌細胞增殖，TGF-β1參與了肥大和增殖過程。Bei Y等研究表明，運動誘發(fā)心臟生理性生長中心肌細胞增殖是不必要的，但運動在保護缺血再灌注損傷中是必需的[27]，因此，運動性心肌肥大是否有心肌細胞增殖產生的心肌細胞有待今后實驗證實。大強度運動可使大鼠心臟肥大，[JP+1]心肌細胞增殖抑制，表明大強度訓練引起的心臟肥大主要以細胞體積增大為主。

4 結論

有氧運動大鼠心肌組織Ki-67和PCNA的表達升高，Ki-67和PCNA陽性細胞數量增多，心肌細胞增殖，有氧運動上調HGF和TGF-β1的表達可能促進心肌細胞增殖的發(fā)生;大強度運動可使心肌組織中Ki-67和PCNA的表達降低，心肌細胞增殖抑制;心肌細胞增殖可能是有氧運動提高心臟功能的一個重要機制。

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