耿 麗 王許平 王丹丹 楊貝貝 杜曉博 高 闖 馮百歲

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院炎癥性腸病中心 吳階平醫(yī)學(xué)基金會中國炎癥性腸病聯(lián)盟 河南省炎癥性腸病中心(450014)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一組病因不明、反復(fù)發(fā)作的腸道慢性炎癥性疾病，主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，其發(fā)病率在全球和我國均呈上升趨勢。目前認(rèn)為IBD的發(fā)生主要與遺傳易感性、腸道內(nèi)環(huán)境以及宿主不恰當(dāng)免疫應(yīng)答有關(guān)[1-2]。氯離子通道(chloride channel,ClC)廣泛分布于多種生物的細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜上，是一類參與氯離子和其他陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)的通道蛋白。電壓門控ClC-2是ClC家族中的一員，近年來越來越多的證據(jù)表明ClC-2參與IBD的發(fā)生、發(fā)展。在腸道中，ClC-2存在于腸上皮細(xì)胞，可調(diào)控包括pH值、電興奮性、離子運(yùn)輸?shù)仍趦?nèi)的多種生理過程和細(xì)胞功能，同時在IBD患者中，ClC-2可調(diào)節(jié)緊密連接復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸黏膜屏障功能，促進(jìn)損傷的腸道上皮進(jìn)行修復(fù)。本文就ClC-2與IBD關(guān)系的研究進(jìn)展作一綜述。

一、ClC-2的生物學(xué)基礎(chǔ)

1.ClC-2的結(jié)構(gòu)和功能：氯離子是生物體內(nèi)含量最豐富的陰離子，其進(jìn)出細(xì)胞除了依靠繼發(fā)性主動運(yùn)輸(如Na+-K+-2Cl-同向轉(zhuǎn)運(yùn)體等)，還可依靠ClC。Miller[3]首先發(fā)現(xiàn)和克隆了電鰩(Torpedo)電器官中的ClC-0，此是首個被發(fā)現(xiàn)的ClC，隨后依次發(fā)現(xiàn)了包括ClC-2在內(nèi)的共9個亞型。ClC-2是由CLCN2基因編碼、907個氨基酸構(gòu)成的相對分子質(zhì)量為99 kDa(1 Da=0.992 1 u)的蛋白質(zhì)。目前已知ClC家族共用一個相對保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)主要由18個部分跨膜、長度不等且反向平行的α螺旋和兩個胞內(nèi)的胱硫醚-β-合成酶結(jié)合域組成。蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)分析表明，ClC通道蛋白的同型二聚體即“雙筒槍(double-barreled)”通道結(jié)構(gòu)是其最小的功能單位[4-5]。ClC-2參與多種生理過程和細(xì)胞功能，且具有器官和組織特異性，如在神經(jīng)系統(tǒng)中抑制γ-氨基丁酸(GABA)反應(yīng)[6]，在視網(wǎng)膜中調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)等[7]。此外還有調(diào)節(jié)細(xì)胞容積、參與鹽的運(yùn)輸、調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性等功能。其在消化系統(tǒng)中的作用并未完全闡明，有動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ClC-2可以調(diào)節(jié)胃液分泌以及在遠(yuǎn)端結(jié)腸中介導(dǎo)氯離子吸收[8-9]。但亦有動物實(shí)驗(yàn)表明，與野生小鼠相比ClC-2-/-小鼠胃液和腸液分泌并無明顯差異，但確定的是ClC-2可調(diào)節(jié)腸黏膜緊密連接[10-11]。

2.ClC-2的分布和調(diào)節(jié)：ClC-2廣泛分布于多種哺乳動物心、腦、腎、消化道等上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。在小腸，其主要分布于小腸絨毛上皮細(xì)胞頂端。此外基底外側(cè)膜、腸上皮細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)亦有所分布，而在隱窩中并無分布[12]。研究[13]表明，在小鼠和豬的小腸中，ClC-2主要分布于緊密連接復(fù)合體所在的區(qū)域，此種分布方式一方面有利于ClC-2與緊密連接復(fù)合體中的分子進(jìn)行交流，另一方面可能與小腸中ClC-2介導(dǎo)氯離子進(jìn)出上皮細(xì)胞有關(guān)。

ClC-2在正電位的情況下處于關(guān)閉狀態(tài)，但可在超極化狀態(tài)下被緩慢激活。細(xì)胞水腫、細(xì)胞外低滲或酸性環(huán)境均可激活ClC-2，此外甲狀腺激素三碘甲狀腺原氨酸(T3)和四碘甲狀腺原氨酸(T4)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞黏附分子(glial cell adhesion molecule,GlialCAM)、脂肪酸等亦對ClC-2具有調(diào)節(jié)作用[4,14-15]。藥物如魯比前列酮(lubiprostone)等可激活腸道上皮細(xì)胞中的ClC-2，誘導(dǎo)小腸液分泌，促進(jìn)受損的腸道黏膜修復(fù)[16-17]。

二、ClC-2與IBD的關(guān)系

1.ClC-2數(shù)量變化與實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎和IBD的關(guān)系：2004年Moeser等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，在缺血損傷的豬回腸黏膜中ClC-2表達(dá)增加，推測其可能與腸道損傷修復(fù)有關(guān)。2009年該團(tuán)隊又發(fā)現(xiàn)在缺血損傷的小鼠空腸中ClC-2表達(dá)增加，而在ClC-2-/-小鼠損傷腸道修復(fù)受阻[13]。近年來，諸多研究表明ClC-2數(shù)量或分布的變化與實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎和IBD密切相關(guān)[18]。Nighot等[19]采用免疫組化法測定小鼠結(jié)腸中ClC-2分布。與健康對照組相比，葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠ClC-2總表達(dá)無明顯變化，但其在小鼠腸道表層上皮的核上胞質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)出明顯聚集狀態(tài)，而在上皮細(xì)胞頂側(cè)膜的分布卻顯著減少。同時發(fā)現(xiàn)在ClC-2-/-小鼠中，腸道通透性和結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度均較健康對照組明顯增加。此外發(fā)現(xiàn)在UC患者體內(nèi)，ClC-2表達(dá)顯著降低。Jin等[20]亦發(fā)現(xiàn)預(yù)防性應(yīng)用ClC-2激活劑魯比前列酮可降低DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，已誘導(dǎo)產(chǎn)生結(jié)腸炎的小鼠應(yīng)用魯比前列酮后可使腸道受損黏膜恢復(fù)加快。

2.ClC-2與腸黏膜屏障：腸黏膜屏障中含有各種高度有序的細(xì)胞間連接，主要包括黏著連接(adherens junction)、橋粒(desmosome)、縫隙連接(gap junction)、緊密連接(tight junction)等[21]，其中緊密連接是調(diào)節(jié)腸上皮屏障功能的重要組分。細(xì)胞間緊密連接主要由多種緊密連接蛋白組成，包括閉鎖小帶蛋白(ZO-1)、封閉蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudins)、鈣黏蛋白(cadherin)等，正常情況下緊密連接是腸道細(xì)胞抵御有害物質(zhì)侵襲的第一道防線[22]。研究指出，緊密連接破壞導(dǎo)致的腸道通透性增加是腸道炎癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素[23-24]。ClC-2主要位于小腸絨毛頂端的緊密連接區(qū)域，在穩(wěn)態(tài)和病理狀態(tài)下其對腸黏膜屏障的作用有所不同，在IBD動物模型中，其可通過調(diào)節(jié)緊密連接的結(jié)構(gòu)和組分進(jìn)而促進(jìn)腸道屏障功能的恢復(fù)。

①ClC-2與正常腸黏膜：ClC-2對正常腸黏膜的作用目前尚存爭議。有研究[25]表明在小鼠正常腸道上皮中ClC-2會導(dǎo)致屏障功能減弱，主要表現(xiàn)為ClC-2-/-小鼠腸道跨上皮電阻(transepithelial electrical resistance,TER)較正常對照組明顯增加，被標(biāo)記甘露醇的清除率明顯降低，提示腸黏膜通透性降低。同時發(fā)現(xiàn)ClC-2-/-小鼠肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)介導(dǎo)的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain， MLC)磷酸化明顯減少。有文獻(xiàn)報道MLCK的誘導(dǎo)激活可破壞細(xì)胞間緊密連接，增加腸黏膜通透性，進(jìn)而減弱屏障功能，該發(fā)現(xiàn)與上述研究結(jié)果一致[26]。ClC-2-/-小鼠與正常小鼠相比，腸絨毛超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為絨毛頂端變細(xì)，橫向紋路增多，且緊密連接界限不清。ClC-2導(dǎo)致正常腸道上皮屏障功能減弱的具體機(jī)制目前尚未明確，推測其可能作為一種離子通道，在腸黏膜上造孔供離子進(jìn)出，從而破壞了黏膜的完整性[27]。然而，另有研究[28]表明，在早期的單層Caco-2細(xì)胞中，用小干擾RNA沉默ClC-2基因會導(dǎo)致TER形成延遲以及影響occludin蛋白定位。同時在ClC-2過表達(dá)的Caco-2細(xì)胞中，菊粉和10 kDa葡聚糖流量明顯降低，同時TER較對照組明顯增加，表明在Caco-2細(xì)胞中ClC-2對上皮屏障功能發(fā)揮有益效應(yīng)[29]。

②ClC-2與受損腸黏膜：腸黏膜屏障是腸道重要的結(jié)構(gòu)和功能屏障，對于水分、離子以及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收至關(guān)重要，同時亦可抵御毒素和病原體入侵[30]。機(jī)械屏障是腸黏膜屏障的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為完整的腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞間的緊密連接。緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致腸壁通透性增加，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)[31]。腸黏膜完整性的破壞和緊密連接的改變在IBD的發(fā)生、發(fā)展過程中至關(guān)重要。

Moeser等[17]研究豬回腸缺血性損傷時發(fā)現(xiàn)前列腺素E2可誘導(dǎo)短路電流產(chǎn)生以及TER顯著增加，提示腸黏膜通透性降低，屏障功能恢復(fù)。進(jìn)一步研究表明該短路電流的產(chǎn)生主要與氯離子分泌有關(guān)，ClC-2與occludin蛋白在上皮細(xì)胞中的共表達(dá)對腸黏膜屏障功能的修復(fù)起著至關(guān)重要的作用。另有研究表明，在DSS誘導(dǎo)的ClC-2基因沉默的Caco-2細(xì)胞中，TER的下降程度顯著高于陰性對照組細(xì)胞[27]。在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，緊密連接蛋白的數(shù)量和分布均與野生型明顯不同，在ClC-2-/-小鼠中此種差異更為顯著。Claudin-2作為一種成孔蛋白，能誘導(dǎo)腸黏膜對小分子物質(zhì)通透性增加，其在IBD動物模型和UC患者中表達(dá)增高[19]，預(yù)防或治療性應(yīng)用ClC-2激活劑后，DSS誘導(dǎo)的野生型小鼠claudin-2表達(dá)顯著降低[20]。此外，ClC-2可介導(dǎo)occludin蛋白在胞膜和胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，occludin蛋白在胞膜的含量減少，在胞質(zhì)中含量增多，ClC-2-/-小鼠由小窩蛋白-1(caveolin-1)和質(zhì)膜微囊參與的occludin蛋白從胞質(zhì)至胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)受限，因此緊密連接恢復(fù)受阻[19,20,27]，目前為止，ClC-2調(diào)節(jié)occludin蛋白運(yùn)輸?shù)木唧w機(jī)制尚未完全闡明，可能與其自身構(gòu)象改變以及胞膜上某些受體有關(guān)，但可明確的是其對多種緊密連接蛋白的調(diào)節(jié)有利于緊密連接復(fù)合體重新裝配，促進(jìn)了DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠腸道屏障功能的恢復(fù)。

上述研究結(jié)果表明，ClC-2在腸黏膜中可能發(fā)揮著雙重作用，一方面在正常腸道中，ClC-2缺失會引起腸黏膜通透性降低以及腸黏膜屏障功能提高，另一方面在IBD等疾病導(dǎo)致的受損腸黏膜中，ClC-2缺失會導(dǎo)致疾病嚴(yán)重度增加，腸道通透性增加，緊密連接復(fù)合體裝配受阻，應(yīng)用ClC-2激活劑則可促進(jìn)腸黏膜屏障功能修復(fù)，提示ClC-2在受損腸黏膜中發(fā)揮保護(hù)作用，該作用可能是通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白在胞膜和胞質(zhì)中的循環(huán)實(shí)現(xiàn)的。

三、ClC-2與細(xì)胞因子

在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中，ClC-2-/-小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β及其mRNA水平較野生型小鼠成倍增加，干擾素(IFN)-γ亦有所增加，此類促炎因子可誘導(dǎo)MLCK激活，破壞細(xì)胞間緊密連接，降低屏障功能，誘導(dǎo)或加重炎癥反應(yīng)[17,19]。同時有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了細(xì)胞間緊密連接通透性的增加與上述occludin蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)無關(guān)[32]。Monteleone等[33]指出，在CD中TNF-α、IFN-γ等可激活輔助性T細(xì)胞17(Th17)等相關(guān)細(xì)胞，引起腸道炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致IBD發(fā)生。這些細(xì)胞因子的改變與ClC-2-/-小鼠結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度一致。此外，Jin等[20]亦發(fā)現(xiàn)，預(yù)防或治療性應(yīng)用ClC-2激活劑后，在DSS誘導(dǎo)的野生型小鼠結(jié)腸炎中，結(jié)腸TNF-α和IL-1β含量明顯降低，IL-10含量增加。在遠(yuǎn)端結(jié)腸中，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β表達(dá)明顯增加，可能與ClC-2激活劑抑制腸道炎癥反應(yīng)，干擾抗炎細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

四、結(jié)語

ClC-2是IBD發(fā)病機(jī)制中起重要作用的一種離子通道，可影響多種細(xì)胞因子的表達(dá)，緩解腸道炎癥，同時在腸黏膜修復(fù)過程中，可通過改變緊密連接蛋白的含量和分布，調(diào)節(jié)緊密連接復(fù)合體的裝配，從而促進(jìn)受損腸黏膜的修復(fù)。對ClC-2的深入研究有助于更好地闡明IBD的發(fā)病機(jī)制，同時可應(yīng)用針對ClC-2的靶向激活藥物，為IBD的治療提供新思路。