李 霞,童曉文

1.同濟大學醫(yī)學院,上海 200092; 2.同濟大學附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科,上海 200065

卵巢癌是危及女性健康的最常見惡性腫瘤之一,其死亡率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首。美國癌癥統(tǒng)計報告顯示,2017年有22 440例卵巢癌新發(fā)病例,14 080例患者死于卵巢癌,2006—2012年卵巢癌5年生存率僅為46%,其死亡率占女性癌癥相關死亡率的5%,是女性癌癥相關死亡的第5大原因[1]。卵巢癌起病隱匿,早期臨床癥狀不典型,缺乏有效的篩查和診斷方法,超過75%的患者就診時已是臨床晚期[2],目前卵巢癌的一線治療方案仍是積極的腫瘤細胞減滅術及術后輔以鉑類和紫杉醇為基礎的聯(lián)合化療,70%～80%患者在一線方案治療后能得到臨床緩解[3-4]。然而,化療耐藥是卵巢癌復發(fā)和治療失敗的最主要原因之一,大約20%～30%的患者在化療時就表現(xiàn)出化療耐藥病情進一步進展,大約25%的患者在化療結(jié)束后6個月內(nèi)會出現(xiàn)病情復發(fā)[5]。鑒于卵巢癌的高復發(fā)率和高死亡率,克服卵巢癌化療耐藥性的研究一直是科研人員關注的熱點問題。小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)可通過RNA干擾作用特異性沉默耐藥相關基因的表達來改善化療藥物的抗癌效果。

1 siRNA作用機制

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介導的特異性基因表達沉默現(xiàn)象,是生物界的一種古老且進化上高度保守的基因表達調(diào)節(jié)機制。1998年Fire等[6]發(fā)現(xiàn)將dsRNA注入線蟲(C.elegans)可特異性抑制與dsRNA同源的基因表達,且dsRNA抑制效果是單鏈RNA的10～100倍。他們將這種dsRNA抑制特定基因表達的現(xiàn)象稱為RNA干擾。siRNA在RNA干擾過程中發(fā)揮核心作用,是RNA干擾途徑中的中間產(chǎn)物,是RNA干擾發(fā)揮效應的必需因子。

小干擾RNA是由dsDNA經(jīng)Dicer酶(RNase Ⅲ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶)加工而成的一種雙鏈小RNA分子(21～25個核苷酸)。細胞內(nèi)可被Dicer酶識別的dsRNA可由多種途徑產(chǎn)生,包括轉(zhuǎn)基因、病毒、轉(zhuǎn)位子和細胞內(nèi)基因等[7]。dsRNA被Dicer酶識別并降解成具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA,即siRNA。siRNA在細胞內(nèi)與一些蛋白(包括AGO蛋白、TRBP蛋白、Dicer酶等)結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。隨后,siRNA的隨從鏈被AGO蛋白切割、釋放出來,引導鏈被保留在成熟有功能的RISC中。siRNA的引導鏈與靶mRNA序列互補配對,啟動序列特異性切割通路,由RISC中的AGO蛋白切割并降解靶mRNA[8]。siRNA不僅能引導RISC切割同源mRNA,還可作為siRNA擴增的模板,在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA,從而使RNAi的作用進一步放大,最終將靶mRNA完全降解[9]。

2 siRNA遞送至卵巢癌

siRNA可以通過RNAi效應特異性地沉默靶向基因,它控制靶向基因表達的能力為基因療法治療癌癥帶來了新的希望。但siRNA 具有較差的藥理特性,如易被血清中的核酸酶降解、有難以滲透血管內(nèi)皮及細胞膜、不易從核內(nèi)體中釋放、先天免疫效應、分子量小易被腎組織排泄等,這對siRNA的臨床應用提出了巨大挑戰(zhàn)[10-11]。因此,開發(fā)一種安全、穩(wěn)定、高效的siRNA遞送系統(tǒng)并將其遞送至細胞或生物體內(nèi),進而發(fā)揮沉默靶向基因的生物效應是至關重要的。目前,將外源性基因?qū)爰毎姆椒ㄖ饕▋纱箢?即病毒載體的遞送和非病毒載體的遞送。

2.1 病毒載體的遞送

以病毒為載體,通過病毒感染的方式將外源基因?qū)氲郊毎惺腔蜻f送的常用方式,其中以腺相關病毒、慢病毒和腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)最為常用。病毒是最早用于體內(nèi)遞送的siRNA的載體,shRNA是具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的siRNA前體,將人工設計合成的shRNA的模板DNA分子通過質(zhì)粒或者病毒轉(zhuǎn)入細胞,在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出shRNA。shRNA經(jīng)Dicer酶剪切成siRNA,進而誘發(fā)RNAi效應抑制靶基因表達。目前已有成熟的商品化的shRNA質(zhì)粒表達載體,如ThermoFisher公司的pSilencer siRNA 表達載體系列。Yan等[12]的研究中用慢病毒介導的shRNA成功敲除UHRF1基因促進了HO-8910和HO-8910細胞凋亡、抑制細胞增殖、降低了腫瘤細胞侵襲能力。Zhu等[13]的研究中同樣利用慢病毒介導shRNA沉默WFDC2 (HE4)基因,以探討其在人卵巢癌細胞系SKOV3細胞增殖、凋亡、運動和侵襲等生物學行為改變的作用及可能機制。

2.2 非病毒載體的遞送

非病毒載體的遞送常用方法包括磷酸鈣共沉淀、顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染等。近年來將siRNA遞送至卵巢癌研究中的常用非病毒載體系統(tǒng)主要集中在脂質(zhì)體、陽離子聚合物、納米無機材料等。

脂質(zhì)體 (liposome) 系指將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊體,按其所帶電荷可分為陽離子、陰離子和中性離子脂質(zhì)體三類。其中陽離子脂質(zhì)體對轉(zhuǎn)染的細胞類型、siRNA類型和分子量有很高的包容性,是脂質(zhì)體中乃至所有siRNA載體中最常見的載體,且脂質(zhì)體可以被進一步表面修飾,在Chen等[14]的研究中構(gòu)建了氧化還原敏感性寡肽脂質(zhì)體以共同遞送紫杉醇(PTX)和抗survivin siRNA(PTX/siRNA/SS-L)。

陽離子聚合物類載體種類多樣,包括聚乙烯亞胺 (polyethyleneimine,PEI)、環(huán)糊精(cyclodextrins,CD)、殼聚糖(chitosan,CH)等,不同的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染效率和安全性因聚合物的結(jié)構(gòu)而有所不同[15-17]。陽離子聚合物還具有生物相容性良好、可生物降解、易修飾等特點,在Teo等[18]的研究中利用葉酸(FA)和PEG修飾的PEI成功地將PD-L1 siRNA傳遞到EOC細胞中,PEG和FA不僅降低了細胞毒性,還通過受體介導的內(nèi)吞作用增強腫瘤細胞對siRNA的靶向吸收。

金、介孔二氧化硅等納米無機材料應用于siRNA 的傳遞在近些年受到廣泛關注[19-20],這得益于納米材料具有負載率高、生物相容性和生物降解性良好等優(yōu)點。除此之外,納米顆粒作為基因載體還可在其表面耦合各種各樣的物質(zhì),如治療藥物、靶向配體、熒光染料等,在Chen等[21]的研究中開發(fā)了一種由Au-Fe3O4納米粒子遞送系統(tǒng),實現(xiàn)siRNA和適配體的共同靶向遞送。

3 siRNA 在耐藥性卵巢癌中的研究

研究發(fā)現(xiàn)多藥耐藥性(multiple drug resistance,MDR)是卵巢癌有效化療的主要障礙之一。多藥耐藥性是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時,對化學結(jié)構(gòu)和作用機制不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥。多藥耐藥形成機制非常復雜,涉及細胞內(nèi)化療藥物積聚濃度的下降,細胞解毒功能增強,細胞凋亡的減少等,與多藥耐藥相關的基因或蛋白包括多藥耐藥基因MDR1及其表達的P-糖蛋白(P-gp)、 多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance-related protein,MRP)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)、肺耐藥蛋白(lung resistance protein,LRP)、DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ、細胞凋亡相關基因等[22-25]。 siRNA通過RNAi效應下調(diào)或者抑制MDR相關基因的表達以改善卵巢癌化療耐藥,提高化療藥物的化療效果,針對這一設想,科研人員對此進行了大量的實驗研究。

3.1 體外研究

MDR1編碼的膜型糖蛋白P-gp屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族,其底物是具有細胞毒性的代謝物或化合物,P-gp能依賴ATP提供能量將底物泵出細胞外。在生理狀態(tài)下P-gp 表達較為廣泛 ,但水平較低。而在腫瘤細胞中 P-gp的過表達則可能是其在MDR型藥物誘導下產(chǎn)生,P-gp作為“藥物排除泵”將化療藥物泵出細胞,導致細胞內(nèi)化療藥物積聚濃度降低而產(chǎn)生耐藥。P-gp低表達可能成為臨床化療中一個有用的預測指標[26-27]。Deng等[28]的研究中就是通過逐漸增加濃度的順鉑(DDP)處理而建立的順鉑耐藥卵巢癌細胞系SKOV-3/DDP,并構(gòu)建包含MDR1基因短發(fā)夾RNA(shRNA)的MDR1 siRNA表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入減毒沙門菌SL7207 株,將SKOV-3/DDP細胞與重組沙門菌一起溫育,結(jié)果顯示與親代細胞系相比,耐DDP的SKOV-3/DDP細胞表達更高水平的MDR1,感染沙門菌株MDR1 siRNA質(zhì)粒的SKOV-3/DDP細胞中MDR1的表達下調(diào),逆轉(zhuǎn)細胞的DDP耐受性。Guo等[29]依據(jù)靜電相互作用設計了LAH4-L1-siRNA納米復合物(LSCs)遞送系統(tǒng),LSCs可以在SKOV-3細胞上實現(xiàn)87.3%的MDR1基因沉默和85%的P-gp下調(diào),更重要的是,結(jié)合化療藥物,SKOV-3細胞生長抑制率可達82.9%。

在Yang等[30]的研究中,引入聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]納米粒子系統(tǒng)作為“雙重RNAi遞送系統(tǒng)”,以包含MDR1和Bcl-2 siRNA。Bcl-2基因是Bcl-2家族的重要成員之一,參與調(diào)控細胞程序性死亡,其在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮重要作用,其表達蛋白可抑制多種組織細胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌表現(xiàn)出Bcl-2基因的過度表達,表達高水平的Bcl-2的卵巢癌對化療藥物耐藥[31-32]。“雙重RNAi遞送系統(tǒng)”用于同時抑制藥物流出和細胞死亡防御途徑。由于兩種途徑的相互依賴性,其顯示出比單獨抑制耐藥卵巢癌細胞中的藥物流出或抗凋亡更強的藥物敏感性,以分別克服紫杉醇和順鉑對紫杉醇耐藥SKOV3-TR和順鉑耐藥A2780-CP20細胞的化療耐藥性。

He等[33]的報告首次使用納米級金屬有機框架(NMOFs)共同傳遞順鉑和三種siRNAs(P-gp、Bcl-2、survivin)至順鉑耐藥SKOV3細胞株。Survivin是凋亡蛋白抑制劑( IAP) 家族成員之一,具有抑制細胞凋亡和維持細胞有絲分裂的雙重功能。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤包括卵巢癌中均有過度表達,抑制survivin的表達可能會導致誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤生長并且促進腫瘤細胞對放化療的敏感性,Survivin可能作為抗腫瘤治療的一個合適靶點[34]。NMOFs保護siRNAs免受核酸酶降解,增強siRNAs的細胞攝取,促進順鉑耐藥的卵巢癌細胞SKOV3中的siRNA從核內(nèi)體逃逸以沉默MDR基因。在體外,根據(jù)細胞活力測定,DNA梯狀條帶等結(jié)果所示,NMOFs共同遞送順鉑和三種siRNAs導致化療效果的提高。

3.2 體內(nèi)研究

在Yang等[35]的研究中,設計基于透明質(zhì)酸(HA)的自組裝納米顆粒HA-PEI/HA-PEG,成功靶向遞送MDR1 siRNA至過表達CD44受體的MDR卵巢癌細胞系OVCAR8TR,除進行細胞實驗有效地下調(diào)OVCAR8TR細胞MDR1和P-gp的表達,還進一步在OVCAR8TR卵巢癌小鼠模型中施用HA-PEI/HA-PEG/MDR1siRNA納米顆粒,隨后使用紫杉醇處理,體內(nèi)實驗結(jié)果顯示HA-PEI/HA-PEG/MDR1siRNA納米顆粒和紫杉醇的聯(lián)合施用對卵巢癌小鼠模型腫瘤生長有顯著抑制作用,有效降低的P-gp表達、增加細胞凋亡。

Salzano等[36]開發(fā)了自組裝聚合物膠束(PM),能夠有效地共同負載survivin siRNA和化療藥物,如紫杉醇(PXL)。在PXL抗性的SKOV3-tr卵巢癌的動物模型中,研究survivin siRNA/PXL PM納米制劑施用后survivin的表達情況,治療功效和生物效應的變化。結(jié)果揭示了腫瘤組織中survivin mRNA和蛋白表達的顯著下調(diào),survivin siRNA/PXL PM具有有效抗癌活性,且腫瘤保持不受相同量的單獨游離PXL影響。與單純使用PXL相比,survivin siRNA/PXL PM使腫瘤細胞對紫杉醇的敏感性明顯增加,細胞凋亡率提高,抗癌活性得到改善。

4 結(jié)語

化療藥物的耐藥性是卵巢癌治療過程中的重大難題,克服化療耐藥、增加化療藥物敏感性成為卵巢癌治研究熱點。siRNA可通過RNA干擾作用沉默耐藥相關基因的表達以提高化療藥物的敏感性,改善化療藥物的抗癌效果。但是,目前的研究主要局限于實驗室,在臨床應用方面還面臨著諸多問題,例如如何設計高效、特異的siRNA序列,開發(fā)安全、高效的siRNA遞送系以及體內(nèi)應用的安全性等。相信隨著該領域研究的不斷深入,siRNA干擾技術在將來可安全、有效地應用于臨床疾病的治療。