曹陽 熊雪豐 肖昌錢

浙江醫(yī)院 浙江 杭州 310013

海馬神經(jīng)元具備中樞神經(jīng)元的典型特征。通過模擬相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制，建立體外海馬細(xì)胞病理模型，進(jìn)行神經(jīng)藥物的篩選及藥效機(jī)制研究是目前常用的藥理研究手段[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，人參具有安神益智之功效，故臨床常用于神經(jīng)衰弱等中樞性神經(jīng)疾病的治療。人參皂苷是人參的主要活性成分，有廣泛的藥理作用[2]，常用的有人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rbl三種。目前未見海馬神經(jīng)細(xì)胞對(duì)人參中不同人參皂苷的吸收及利用程度相關(guān)報(bào)道。本文對(duì)三種常用人參皂苷在海馬細(xì)胞內(nèi)外含量進(jìn)行比較，從細(xì)胞內(nèi)外藥物濃度變化的角度闡述不同人參皂苷對(duì)海馬細(xì)胞的作用差異，為臨床上使用人參治療相關(guān)神經(jīng)性疾病提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器：Thermo Ultimate 3000 HPLC高效液相色譜系統(tǒng)、高壓泵、CAD（Charged Aerosol Detector）檢測(cè)器、Thermo Ultimate 3000 colcumn compartment柱溫箱、Chromeleon 7數(shù)據(jù)處理器（Thermo Fisher Scientific company）；Anke TGL-16B高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KUDOS SKF-6A超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；Capcell C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；AT201型電子天平（梅特勒-托利多上海儀器有限公司）；311型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，USA）；ECLIPSE Ti型倒置熒光顯微鏡（Nikon，Japan）。

1.2 對(duì)照品：人參皂苷Rg1（批號(hào)110703-201426）、人參皂苷Re（批號(hào)110754-201422）、人參皂苷Rb1（批號(hào)110704-201420）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量均≥98%。

1.3 試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、D-Hank’s緩沖液（Hyclone公司）；Neuralbasal培養(yǎng)基、B27、胎牛血清（Gibco公司）；青霉素和鏈霉素（Sigma公司）；谷氨酰胺、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原蛋白酶、細(xì)胞裂解液（杭州昊天生物技術(shù)有限公司）；甲醇和乙腈（色譜級(jí)，Merck公司），水為純凈水，其它試劑均為分析純。

1.4 動(dòng)物：SPF級(jí)新生SD大鼠，雄性，體重10±2g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（浙）2008-0033。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：色譜柱-Capcell C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），采用兩相梯度洗脫：0～10min，A為19%；10～40min，A為19%～25%；40～45min，A為25%～31%；45～60min，A為31%～37%；檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm；流速：1ml/min；柱溫：25℃，進(jìn)樣體積：20μl。在該系統(tǒng)條件下各峰分離度良好，理論塔板數(shù)均大于3000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品2.124mg，人參皂苷Re對(duì)照品2.045mg和人參皂苷Rb1對(duì)照品2.087mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成含人參皂苷Rg1、Re和Rb1分別為212.4mg/L、204.5mg/L和208.7mg/L的混合對(duì)照品溶液。

2.3 細(xì)胞內(nèi)、外液樣品的分組和制備：取新生SD大鼠，采用原代培養(yǎng)法分離海馬細(xì)胞[3]。將細(xì)胞懸液種植于6孔板中，置于37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，24h后全量換維持培養(yǎng)基，以后隔天半量換液。1周左右待海馬細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%，加入各含100.0mg/L的三種人參皂苷混合對(duì)照品培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24h后用PBS充分沖洗細(xì)胞，并用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于1.5ml離心管，3000r/min離心5min，棄上清液，加細(xì)胞裂解液溶解細(xì)胞，再次離心后取上清液，得細(xì)胞內(nèi)液。分別取1ml細(xì)胞內(nèi)外液，置于5ml離心管中，加1.5ml乙酸乙酯，渦旋振蕩混勻，經(jīng)50000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，揮干溶劑，用100μl甲醇重溶，再次50000r/min離心10min，取上清液分別作為細(xì)胞內(nèi)外供試品溶液。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證：分述如下。

2.4.1 線性關(guān)系考察：精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0ml，用甲醇稀釋定容到10ml，分別進(jìn)樣20μl。以對(duì)照品人參皂苷Rg1、Re和Rb1的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，得3個(gè)線性回歸方程，見表1。結(jié)果表明人參皂苷Rg1、Re和Rb1在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 三種人參皂苷線性范圍及檢出限

2.4.2 精密度試驗(yàn)：取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、Re和Rb1的日內(nèi)RSD分別為1.71%、1.33%、1.47%，表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“2.3”項(xiàng)下同一供試品溶液，室溫放置，分別于1、2、4、8、12、24h取樣20μl，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、Re和Rb1的RSD分別為2.24%、1.16%、2.12%，表明在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)：取“2.3”項(xiàng)下同一細(xì)胞供試品溶液各3份，同法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、Re和Rb1的RSD分別為0.45%、0.59%、0.67%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)：取“2.3”項(xiàng)下已知三種人參皂苷含量的細(xì)胞供試品溶液9份，按照高、中、低比例，加入適量對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下同法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、Re和Rb1平均回收率分別為98.32%、98.47%和96.74%，RSD分別為2.18%、3.05%、3.34%。

2.5 樣品含量測(cè)定：分別收集加入含藥培養(yǎng)液后0、1、2、4、8、24h時(shí)的細(xì)胞外培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi)液各1ml，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，分別進(jìn)樣20μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其含量，結(jié)果見圖1，表2。

圖1 海馬細(xì)胞胞外藥物含量-時(shí)間曲線（n=3）

表2 海馬細(xì)胞對(duì)三種人參皂苷的吸收利用比較結(jié)果（n=3）

3 討論

人參是傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，可加強(qiáng)大腦皮層的興奮和抑制過程，調(diào)節(jié)兩者平衡，降低大腦興奮過程的疲憊性，提高記憶力，具有安神益智之功效。其主要成分人參皂苷具有相似的基本結(jié)構(gòu)，都含有由30個(gè)碳原子排列成四個(gè)環(huán)的甾烷類固醇核，其藥理作用類似，但藥效作用也各有側(cè)重。本實(shí)驗(yàn)建立的海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外液中同時(shí)檢測(cè)人參皂苷Rg1、Rb1和Re的方法簡(jiǎn)便、靈敏，經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，其準(zhǔn)確度、精密度和回收率上都達(dá)到了生物分析的要求。圖1和表2顯示，細(xì)胞外液中三種人參皂苷的含量均在2h內(nèi)顯著降低，而在2～24h之間含量變化不大，說明三種人參皂苷基本在2h內(nèi)被海馬細(xì)胞吸收飽和。24h時(shí)海馬神經(jīng)細(xì)胞對(duì)人參皂苷Rg1、Re和Rb1的平均吸收率分別為9.55%、13.76和80.3%。通過測(cè)定培養(yǎng)24h后胞內(nèi)殘留的藥物含量，人參皂苷Rg1、Re和Rb1的轉(zhuǎn)化率分別為83.56%、80.23%和88.66%。表明在相同培養(yǎng)條件下，海馬神經(jīng)細(xì)胞對(duì)三種人參皂苷的吸收和轉(zhuǎn)化利用各有差異，吸收率依次為：人參皂苷Re＞人參皂苷Rg1＞人參皂苷Rb1，轉(zhuǎn)化利用率依次為：人參皂苷Rb1＞人參皂苷Rg1＞人參皂苷Re。這可能與三種人參皂苷成分分子量大小和結(jié)構(gòu)存在差異有關(guān)：分子量較小和親脂性強(qiáng)的藥物更容易進(jìn)入細(xì)胞，而細(xì)胞對(duì)藥物的轉(zhuǎn)化也有優(yōu)先選擇效應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)表明，海馬細(xì)胞對(duì)不同種類人參皂苷的生物代謝存在差別，為人參皂苷在臨床上中樞神經(jīng)性疾病的防治提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]黃孝聞，王緒平，壽旦.海馬神經(jīng)元細(xì)胞模型及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（11）：2730-2733.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：8-9.

[3]孫琪，徐志偉，敖海清，等.大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞體外原代培養(yǎng)與鑒定[J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21（5）：461-464.