談夢(mèng)飛，高謙，王建梓，喬長(zhǎng)晟，，*

（1.天津科技大學(xué)工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，天津300457；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；4.天津科技大學(xué)食品工程與技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

普魯蘭多糖是一種微生物胞外多糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是以麥芽三糖為單體聚合而成[1]，主要由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）發(fā)酵產(chǎn)生。麥芽三糖通過(guò)α-1，6糖苷鍵結(jié)合起來(lái)的高分子聚合物，其分子量（Mw）分布范圍廣泛，通常在 4.8×104Da～2.2×106Da，約480個(gè)麥芽三糖單體[1]，培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分以及生產(chǎn)菌株變化的影響，聚合度大小隨之改變[2]。普魯蘭多糖因其具備無(wú)毒且生物安全的特性，被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域[3]，其優(yōu)良的理化性質(zhì)決定了其具備廣闊的應(yīng)用前景。

普魯蘭多糖合成途徑中的3種關(guān)鍵酶分別是α-磷酸葡萄糖變位酶（PGM），UDPG焦磷酸化酶（UGPase），磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶[4]。Shingel報(bào)道稱尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）是合成普魯蘭多糖必要的前體物[5]。UDPG是由PGM和UGPase催化轉(zhuǎn)化不同碳源所得的[6]。Catley等[7]提出了短梗霉多糖形成多糖的進(jìn)程中，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化下UDPG中的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移，并與脂質(zhì)分子連接形成普魯蘭多糖鏈。就目前研究來(lái)看[8-9]，出芽短梗霉以蔗糖為碳源發(fā)酵，普魯蘭多糖轉(zhuǎn)化率最高。因此推測(cè)普魯蘭多糖合成的可能途徑，如圖1所示。因此，PGM和UGPase的活性都對(duì)普魯蘭多糖合成起著至關(guān)重要的作用[10]，本文研究了不同pH值條件對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響，并提出雙階段調(diào)控pH值來(lái)進(jìn)一步提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，同時(shí)以UDPG含量及PGM和UGPase活性的變化來(lái)分析普魯蘭多糖合成機(jī)理。

圖1 普魯蘭多糖合成大致代謝流程Fig.1 proposed pathway of pullulan synthesis in A.pullulans

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）：保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。保藏號(hào)：CGMCCNO.7055。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

08-F25型5 L自動(dòng)發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司；TDL-5-A型高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；Agilent 1200液相色譜分析儀：美國(guó)安捷倫公司；Infinite ?200 Pro NanoQuant酶標(biāo)儀：瑞士Tecan公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖100、酵母浸粉3、（NH4）2SO41、K2HPO42、MgSO4·7H2O 0.4、NaCl 2.5、FeSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，121 ℃滅菌 20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 150、蛋白胨 5、K2HPO47、MgSO4·7H2O 0.4、NaCl 3、FeSO4·7H2O 0.05，按0.0001%量添加泡敵（植物油），121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 分批發(fā)酵培養(yǎng)方法

在培養(yǎng)好的斜面上挑取一環(huán)孢子接入裝液量為100 mL的500 mL擋板瓶中，28℃，180 r/min搖床恒溫培養(yǎng)28 h～32 h，制得種子液。將種子液以3%的接種量接入裝液量為3 L的5 L發(fā)酵罐中，通風(fēng)比為1：1.25，發(fā)酵前24 h溫度維持在32℃，24 h后溫度調(diào)節(jié)到28℃，罐壓恒定在0.02 MPa，初始pH6.0，轉(zhuǎn)速：400 r/min。

1.2.2 發(fā)酵試驗(yàn)分析方法

1.2.2.1 多糖的測(cè)定[11-12]

將發(fā)酵液5 000 r/min離心20 min后，取30 mL上清液加入兩倍體積乙醇，攪拌均勻，靜置1 h后抽濾，所得多糖置于105℃干燥至恒重。

1.2.2.2 生物量的測(cè)定[13]

發(fā)酵液離心后，將上清液倒出，隨后用蒸餾水洗滌菌體2次～3次后，所得菌體于80℃烘箱至恒重，稱重。

1.2.3 無(wú)細(xì)胞提取液制備

量取15 mL發(fā)酵液，在4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，用冷凍0.9%NaCl溶液將菌體洗滌3次后，將菌體重懸于1.0 mL預(yù)冷的1 mol/L的Tris-HCl（pH7.6）緩沖液。使用超聲破碎儀破碎30 min后，在4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，去除細(xì)胞碎片?？偟鞍缀恳訠radford方法測(cè)定[14]。

1.2.4 尿苷二磷酸葡萄糖含量的測(cè)定[15]

利用安捷倫帶有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜檢測(cè)尿苷二磷酸葡萄糖含量。液相條件：色譜柱：J&KCHEICA HPLC column C18（5 μm，250 mm ×4.6 mm i.d.），流動(dòng)相：pH6.0的40 mmol/L三乙銨醋酸鹽緩沖溶液，柱溫：22 ℃，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.5 磷酸葡萄糖變位酶酶活的測(cè)定（PGM）

在翟自立[16]等的方法上進(jìn)行改進(jìn)。反應(yīng)混合物 60 mmol/L Tris-HCl（pH7.0），7 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L NADP，5 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L 葡萄糖-1，6-二磷酸，2U葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和30μL適量稀釋的無(wú)細(xì)胞提取液，反應(yīng)2 min，加入0.1 mmol/L葡萄糖-1-磷酸至終體積250 μL。在340 nm下測(cè)定光密度，一個(gè)酶活力單位定義為：每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物的酶量所需酶量。

1.2.6 UDPG焦磷酸化酶酶活的測(cè)定（UGPase）

在Duan等[4]的方法上進(jìn)行改進(jìn)。反應(yīng)混合物包括 60 mmol/L Tris-HCl（pH7.0），8 mmol/L MgCl2，1 mmol/L UDPG，2.1 U磷酸葡萄糖變位酶（PGM），4 U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH），0.4 mmol/L NADP+，4 mmol/L無(wú)機(jī)磷酸鹽和30 μL適量稀釋的無(wú)細(xì)胞提取液至終體積250 μL。在30℃條件下開(kāi)始反應(yīng)。在340 nm下測(cè)定吸光值。一個(gè)酶活力單位定義為：每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物的酶量所需酶量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)處理獨(dú)立重復(fù)3次，采用Microsoft Excel 2007、origin8.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同初始pH值對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響

利用 500 mL 擋板瓶對(duì)初始 pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5條件下發(fā)酵普魯蘭多糖進(jìn)行研究，結(jié)果如表1所示。

表1 不同初始pH值對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響Table 1 Effect of initial pH on pullulan fermentation

根據(jù)表1可以看出，在初始pH 6.0條件下，普魯蘭多糖的產(chǎn)量最高達(dá)到（63.75±0.09）g/L，同時(shí)生物量達(dá)到（9.23±0.31）g/L。初始pH值調(diào)至7.5時(shí)普魯蘭多糖產(chǎn)量和生物量均最低，發(fā)現(xiàn)普魯蘭多糖產(chǎn)量隨初始pH值降低而逐漸增高，由此可推斷出芽短梗霉在偏弱酸性環(huán)境下更利于合成普魯蘭多糖。而初始pH5.5時(shí)普魯蘭多糖產(chǎn)量又低于初始pH6.0，故普魯蘭多糖發(fā)酵初始pH值過(guò)低不利于多糖合成。因此，選擇初始pH6.0作為普魯蘭多糖發(fā)酵初始pH值條件。

隨后，對(duì)初始pH6.0條件下發(fā)酵普魯蘭多糖進(jìn)行5 L罐驗(yàn)證試驗(yàn)，各發(fā)酵參數(shù)的變化趨勢(shì)如圖2所示。

圖2 初始pH6.0對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響Fig.2 Effect on fermenting pullulan under condition of initial pH6.0

由圖2可以看出在發(fā)酵32 h～64 h大量合成普魯蘭多糖，而64 h后，普魯蘭多糖產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。生物量在24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，而64 h后再升高。不難推測(cè)，隨著多糖合成減慢甚至基本停滯，碳代謝向出芽短梗霉菌體合成方向轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致生物量不斷升高。還可以看出隨普魯蘭多糖產(chǎn)量增加，由于有機(jī)酸合成加劇，發(fā)酵pH值也隨之逐漸下降。在64 h后pH值逐漸趨于平緩，而此時(shí)多糖合成量亦趨于停滯，可見(jiàn)當(dāng)pH值降低至4.5以下甚至更低時(shí)，不利于普魯蘭多糖合成。因此，控制pH值發(fā)酵恒定在6.0、5.5、5.0研究普魯蘭多糖發(fā)酵的影響。

2.2 不同恒定pH值對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響

不同恒定pH值對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同恒定pH值對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響Fig.3 Effect on biomass by fermented pullulan under different stable pH value

利用5 L發(fā)酵罐分別對(duì)恒定pH6.0、5.5、5.0對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響進(jìn)行研究，由圖3（A）可以看出維持發(fā)酵pH值恒定延長(zhǎng)了出芽短梗霉對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間，恒定pH值為6.0和5.5的兩試驗(yàn)組在發(fā)酵48 h后，生物量高于初始pH6.0該空白組，同時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，生物量分別為（10.24±0.33）g/L和（11.89±0.316）g/L，始終維持恒定pH值至6.0和5.5，雖然生物量高，但是菌體生長(zhǎng)速率變低。而恒定pH5.0組不僅菌體生長(zhǎng)緩慢，并且生物量一直處于較低水平，可見(jiàn)在普魯蘭多糖發(fā)酵開(kāi)始階段，pH值偏低不利于菌體生長(zhǎng)。另外，維持恒定pH6.0、5.5、5.0這3組的普魯蘭多糖產(chǎn)量始終低于初始pH6.0組，見(jiàn)圖3（B），并且根據(jù)pH值由高到低，終產(chǎn)量也呈由高到低的趨勢(shì)，終產(chǎn)量依此為（45.73±2.41）、（39.15±1.45）、（33.21±2.1）g/L。由此可見(jiàn)在發(fā)酵過(guò)程中pH值始終恒定于某一特定值對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵起到抑制作用，降低普魯蘭多糖產(chǎn)量。

2.3 不同雙階段控制pH值對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響

由于始終將pH值控制恒定為某一特定值對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量并無(wú)明顯提高。同時(shí)在監(jiān)控初始pH6.0組發(fā)酵普魯蘭多糖過(guò)程中pH值的變化趨勢(shì)，可發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（即發(fā)酵24 h）后，普魯蘭多糖合成量急劇增加，此階段發(fā)酵pH值范圍在4.5到5.5范圍。因此對(duì)采用雙階段調(diào)控pH值方式發(fā)酵普魯蘭多糖進(jìn)行研究。不同雙階段控制pH值下的普魯蘭多糖產(chǎn)量及生物量見(jiàn)表2。

表2 不同雙階段控制pH值下的普魯蘭多糖產(chǎn)量及生物量Table 2 pullulan and biomass under fermented condition of twophase controlling pH valve

以初始pH6.0為空白組，發(fā)現(xiàn)第二階段pH值控制在4.5組（即pH6.0～4.5組）的生物量在發(fā)酵結(jié)束時(shí)最高，達(dá)到（16.75±0.36）g/L，而第二階段控制在5.0，5.5（即 pH6.0～5.0組、pH6.0～5.5 組）的生物量亦高于空白組，可見(jiàn)在菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后調(diào)節(jié)pH值維持恒定更利于菌體生長(zhǎng)，并且pH值較低時(shí)菌體合成量越高。但從表2，可看出pH6.0～5.0試驗(yàn)組的產(chǎn)量最高，較空白組高出22.5%，而pH6.0～4.5多糖產(chǎn)量不如pH6.0～5.0組，證明pH6.0～4.5組相較于pH6.0～5.0組更適于菌體合成，而菌體合成普魯蘭多糖的能力弱于pH6.0～5.0組。

2.4 不同pH值條件對(duì)磷酸葡萄糖變位酶（PGM）和UDPG焦磷酸化酶（UGPase）活性的影響

pH值對(duì)UDPG焦磷酸化和磷酸葡萄糖變位酶酶活性的影響見(jiàn)圖4。

UDPG焦磷酸化酶（UGPase）是催化葡萄糖-1-磷酸與UTP生成普魯蘭多糖合成重要前體尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）的關(guān)鍵酶（如式 1），UGPase活性可直接影響UDPG的合成。其中葡萄糖-1-磷酸由磷酸葡萄糖變位酶（PGM）催化6-磷酸葡萄糖所得，因此PGM活性也會(huì)間接的影響UDPG的合成。所以這種酶普魯蘭多糖發(fā)酵起到尤為重要的影響。

圖4 pH值對(duì)UDPG焦磷酸化和磷酸葡萄糖變位酶酶活性的影響Fig.4 Effect of different pH on UDPG-pyrophosphorylase and phosphoglucomutase activity

從圖4總體可看出，在pH6.0～5.0條件下發(fā)酵80 h后UGPase和PGM的活性均高于其他pH條件下的活力，同時(shí)此條件下的多糖產(chǎn)量也高于其他組，這一結(jié)果顯示這些pH值條件下的酶活力與普魯蘭多糖的生產(chǎn)規(guī)律相似，因此證明了這兩種酶對(duì)多糖生產(chǎn)的影響。在初始pH6.0條件下UGPase和PGM的活性與pH6.0～4.5組相近，同時(shí)普魯蘭多糖產(chǎn)量相近，分別為（65.21±2.78）g/L 和 63.21 g/L，而此時(shí)初始pH6.0條件下的發(fā)酵pH值為4.76左右，證明這兩種酶的活性對(duì)pH值變化較為敏感。在后期控制pH值恒定的四組中酶活力受pH值影響，隨pH值由低到高，呈現(xiàn)一種先降低后升高的變化趨勢(shì)，并在pH5.0表現(xiàn)出最高比活力，同時(shí)可以觀測(cè)出普魯蘭多糖產(chǎn)量呈現(xiàn)這一態(tài)勢(shì)。從而可在酶學(xué)上印證后期調(diào)節(jié)pH值至5.0更利于普魯蘭多糖合成。而生物量的變化受酶活影響并不十分明顯，初始pH值6.0組在發(fā)酵80 h時(shí)酶活與pH6.0～4.5酶活基本一致而生物量卻差異明顯。后期調(diào)控pH值的四組，生物量則與pH值的變化相關(guān)，可看出后期pH值偏低更利于菌體生長(zhǎng)。

2.5 雙階段pH6.0～5.0對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響及機(jī)理分析

雙階段控制pH值對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響見(jiàn)圖5。

圖5 雙階段控制pH值對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響Fig.5 Change fermenting pullulan under two-phase control of pH value

利用5 L發(fā)酵罐對(duì)pH6.0～5.0組進(jìn)行產(chǎn)量驗(yàn)證，每隔8 h取樣一次。普魯蘭多糖多糖合成及生物量累積趨勢(shì)如圖5所示，普魯蘭多糖產(chǎn)量在發(fā)酵80h時(shí)達(dá)到最高，相較于僅調(diào)節(jié)初始pH6.0發(fā)酵時(shí)間縮短8 h左右，同時(shí)產(chǎn)量也有顯著提高，此時(shí)普魯蘭多糖產(chǎn)量達(dá)到（92.5±2.41）g/L，生物量達(dá)到（13.95±0.35）g/L。發(fā)酵80 h后繼續(xù)反應(yīng)，普魯蘭多糖產(chǎn)量開(kāi)始下降，同時(shí)生物量增高，發(fā)酵96 h生物量增高值（14.91±0.29）g/L，而普魯蘭多糖產(chǎn)量下降至（81.33±2.01）g/L。產(chǎn)生此現(xiàn)象可能是由于普魯蘭多糖積累到一定水平，對(duì)其合成產(chǎn)應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，從而使普魯蘭酶開(kāi)始分解普魯蘭多糖，為菌體合成提供碳源，從而使生物量有明顯增長(zhǎng)。UDPG含量的變化趨勢(shì)也同樣印證了這一點(diǎn)，UDPG含量先處于較高水平，隨普魯蘭多糖合成加劇，UDPG含量迅速下降并在多糖產(chǎn)量達(dá)到最高時(shí)處于最低谷，在多糖產(chǎn)量降低時(shí)又有些許上升。又經(jīng)相關(guān)性檢驗(yàn)得出兩者相關(guān)性系數(shù)為-0.905，則普魯蘭多糖產(chǎn)量與UDPG含量在0.01水平上顯著相關(guān)，由于相關(guān)性系數(shù)為負(fù)，所以兩者呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論

經(jīng)上述試驗(yàn)證明，分階段控制pH值對(duì)于普魯蘭多糖合成以及出芽短梗霉菌體生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用。分階段控制pH值的第一階段即初始pH值調(diào)節(jié)為6.0利于菌體生長(zhǎng)和生物量積累，而第二階段控制pH值恒定于5.0誘導(dǎo)發(fā)酵，促進(jìn)普魯蘭多糖合成，同時(shí)發(fā)酵終止時(shí)間提前8 h，最終生物量到達(dá)（13.87±0.89）g/L，終產(chǎn)量達(dá)到（92.5±2.41）g/L左右。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證pH6.0～5.0此雙階段pH值調(diào)控方式可使PGM和UGPase活性高于其他控制階段，并且得出普魯蘭多糖產(chǎn)量與UDPG含量變化成顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

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