西葫蘆胚囊再生植株快速繁殖及倍性鑒定

宋金亮，朱 磊，賈聖風(fēng)，武向斌，張凱歌，孫守如

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河南鄭州450002)

西葫蘆(Cucurbita pepo L.)，別名美洲南瓜，為葫蘆科南瓜屬1年生蔓生草本植物，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能，且產(chǎn)量高、耐儲(chǔ)運(yùn)。西葫蘆作為我國普遍栽培的一種瓜類蔬菜，種植面積在逐年增加，保護(hù)地栽培面積僅次于黃瓜，但其育種研究相對(duì)于其他葫蘆科瓜類較為滯后，新品種更新較慢。常規(guī)育種在一定程度上限制了雜交一代的選育速度，而離體雌核培養(yǎng)產(chǎn)生的單倍體通過自然或人工加倍可快速獲得雙單倍體純系，以便配置雜交組合，進(jìn)而加快育種進(jìn)程［1-2］。近年來，關(guān)于西葫蘆未受精胚珠或未授粉子房離體培養(yǎng)的報(bào)道較多，離體雌核培養(yǎng)技術(shù)也取得了一定的進(jìn)展［3-6］。盡管多數(shù)研究經(jīng)胚狀體或愈傷組織途徑獲得了胚囊植株，但再生植株誘導(dǎo)率低，倍性鑒定體系不完善的問題依然存在［7］。利用莖尖與腋芽離體培養(yǎng)可以對(duì)稀缺材料進(jìn)行長期保存與快速繁殖，同時(shí)避免優(yōu)良性狀的分離與丟失［8］。莖尖快繁技術(shù)在馬鈴薯［9］、山藥［10］、草莓［11］等作物的育種中應(yīng)用廣泛。開展西葫蘆離體雌核再生植株快繁技術(shù)的研究對(duì)保持植株優(yōu)良性狀、胚囊植株倍性育種及進(jìn)行后代遺傳分析都有重要意義［12］。因此，以西葫蘆胚囊植株莖尖為外植體，系統(tǒng)研究了不同種類及其不同質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)再生胚囊植株莖尖增殖及再生腋芽生根的影響，比較了莖尖、根尖以及卷須3種部位的組織利用染色體計(jì)數(shù)法進(jìn)行倍性鑒定的差異，并對(duì)西葫蘆氣孔密度及保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)與倍性的關(guān)系進(jìn)行探索，旨在建立一種高效可行的西葫蘆胚囊植株莖尖快速繁殖方法，并為西葫蘆倍性鑒定的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與培養(yǎng)條件

以西葫蘆品種ZY10號(hào)為試材，該品種生長力旺盛，產(chǎn)量高，且具有較強(qiáng)的低溫弱光耐受性［13］。8月初穴盤育苗，待幼苗長到三葉一心(苗齡15 d左右)定植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊科教園區(qū)溫室內(nèi)。于花期即從第三雌花開始采樣，開花前1 d 18:00左右采摘未授粉子房，以 MS+0.06 mg/L TDZ+0.5 mg/L 6－BA為培養(yǎng)基進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)，然后將誘導(dǎo)胚狀體轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)并獲得再生胚囊植株。試驗(yàn)均以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，根據(jù)試驗(yàn)要求添加植物生長調(diào)節(jié)劑，瓊脂7 g/L、蔗糖30 g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2 500～3 000 lx，光照周期為 14 h/10 h。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 增殖培養(yǎng) 將再生胚囊植株莖尖接種到增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)置添加不同質(zhì)量濃度的 6－BA(0.25、0.50、1.00 mg/L)和NAA(0.50 mg/L)，篩選出莖尖增殖的最適培養(yǎng)基。每處理接種16個(gè)外植體，重復(fù)3次，接種30 d后統(tǒng)計(jì)芽苗增殖情況。增殖倍數(shù)=增殖芽總數(shù)/接種外植體數(shù)，增殖率=增殖的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.2 生根培養(yǎng) 當(dāng)腋芽長到2～3 cm時(shí)，由基部切斷后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)置添加不同質(zhì)量濃度的 NAA(0.1、0.25、0.50 mg/L)和 IBA(0.1、0.5 mg/L)，篩選出最適生根培養(yǎng)基。每處理接種10個(gè)再生腋芽，重復(fù)3次，10 d后開始記錄生根情況，接種20 d后統(tǒng)計(jì)生根率。生根率=生根外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.3 倍性鑒定方法

1.2.3.1 染色體計(jì)數(shù)法 以西葫蘆莖尖(植株生長點(diǎn))、根尖及卷須為材料，參考王艦等［14］的方法并稍作改進(jìn)。具體步驟如下:9:00左右，分別取莖尖、根尖、卷須1～2 cm，放入0.1%秋水仙素水溶液預(yù)處理3 h，用改良的卡諾氏固定液固定24 h，將固定后的材料經(jīng)95%乙醇和85%乙醇各浸泡30 min，用蒸餾水漂洗3～4次，每次2 min，用60℃ 1 mol/L HCl溶液解離10 min，解離后用蒸餾水沖洗3 min并用濾紙吸干，用改良苯酚品紅染色液染色20 min，切取分生區(qū)部分，用鑷子將材料搗碎，滴1滴45%的冰醋酸，蓋上蓋玻片，用橡皮輕輕敲擊使根尖分散，在400倍顯微鏡下進(jìn)行染色體數(shù)目的觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.3.2 氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法 參照張菊平等［15］的方法并稍作改進(jìn)。具體步驟如下:用刀片輕輕在葉下表皮的葉脈上劃一個(gè)裂口，用鑷子從裂縫處撕取下表皮置于載玻片上，并將其展平，滴2滴1%碘－碘化鉀(用蒸餾水稀釋后效果更好)，染色3 min，在100倍顯微鏡下，以視野內(nèi)的面積(1.77 mm2)進(jìn)行觀察比較，每張葉片隨機(jī)觀察統(tǒng)計(jì)30個(gè)視野內(nèi)的氣孔數(shù)及葉綠體數(shù)，拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，運(yùn)用SPSS 16.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和χ2適合性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)西葫蘆莖尖增殖的影響

將西葫蘆胚囊植株莖尖接種到增殖培養(yǎng)基上，試驗(yàn)結(jié)果顯示(表1、圖1)，培養(yǎng)14 d后可見萌發(fā)的腋芽，28 d后形成叢生不定芽。在基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基上，50%的苗芽能夠誘導(dǎo)形成腋芽，芽苗增殖倍數(shù)為1.50。當(dāng)添加0.50 mg/L的NAA時(shí)，莖尖不能得到有效的增殖，增殖倍數(shù)為0，芽苗基部形成大的愈傷塊，植株生長勢(shì)弱，其中有4株死亡。培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的6－BA對(duì)腋芽的增殖率影響顯著，當(dāng)6－BA質(zhì)量濃度為0.50 mg/L 時(shí)，75.0%的芽苗能增殖出腋芽，最多增殖出3個(gè)，平均每個(gè)芽苗可生成2.37個(gè)，其次是6－BA 為 0.25 mg/L 時(shí)，增值倍數(shù)為 1.88，當(dāng) 6－BA 質(zhì)量濃度為1.00 mg/L 時(shí)，增殖倍數(shù)較低，僅為 1.63，但高于基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基處理。結(jié)合增殖倍數(shù)及生長勢(shì)，篩選出西葫蘆胚囊植株莖尖增殖的最適培養(yǎng)基為MS+0.50 mg/L 6－BA。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度組合對(duì)西葫蘆胚囊植株莖尖增殖的影響

圖1 西葫蘆再生植株擴(kuò)繁

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度對(duì)西葫蘆增殖腋芽生根的影響

將誘導(dǎo)增殖出的健壯不定腋芽接種到生根培養(yǎng)基上，結(jié)果表明(表2、圖1)，不同種類及質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑均能誘導(dǎo)西葫蘆腋芽生根，使用NAA和IBA處理影響差異顯著。培養(yǎng)基中添加0.50 mg/L的IBA時(shí)，基部愈傷化嚴(yán)重，生根率最低，僅為13.3%。在本試驗(yàn)中，NAA的誘導(dǎo)效果普遍較IBA好，其中以0.10 mg/L NAA處理的生根率最高，達(dá) 83.3%，其次為 0.25 mg/L NAA，生根率為50.0%。提高NAA質(zhì)量濃度，生根率逐漸下降，生根變粗且根毛減少，基部愈傷增多，繼代培養(yǎng)后移栽存活率降低，與前人在西瓜上報(bào)道的結(jié)果一致［16-17］。因此，MS+0.10 mg/L NAA 為西葫蘆再生腋芽最適宜的生根培養(yǎng)基。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)西葫蘆增殖腋芽生根的影響

2.3 西葫蘆不同組織進(jìn)行染色體鑒定的差異

由圖2、表3可知，在400倍顯微鏡下3種組織材料均可觀察到染色體。用莖尖作為鑒定材料時(shí)，細(xì)胞密度大，但體積小，細(xì)胞內(nèi)染色體重疊，嚴(yán)重影響倍性鑒定。根尖作為鑒定材料時(shí)，細(xì)胞密度大，體積也較大，大部分細(xì)胞重疊，細(xì)胞內(nèi)染色體稍有重疊，染色體較清晰，基本可進(jìn)行倍性鑒定。而卷須作為鑒定材料時(shí)，細(xì)胞大，分散，基本無重疊，細(xì)胞內(nèi)染色體清晰。由此可知，西葫蘆卷須可作為根尖染色體計(jì)數(shù)的替代材料。

圖2 西葫蘆再生植株倍性鑒定

表3 西葫蘆不同組織對(duì)染色體鑒定的影響

2.4 西葫蘆氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)與倍性的相關(guān)性

對(duì)不同倍性西葫蘆葉片氣孔密度及保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)進(jìn)行比較可知(圖2、圖3)，氣孔數(shù)隨倍性的增加而減少，葉綠體數(shù)隨倍性的增加而增加。單倍體氣孔數(shù)平均值為112個(gè)，而二倍體的氣孔數(shù)平均值為55個(gè)，差異極顯著(P＜0.01)。單倍體和二倍體的葉綠體數(shù)平均分別為4.79個(gè)和8.79個(gè)，差異顯著(P＜0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，二倍體與單倍體葉綠體數(shù)平均值的比值約為1.84∶1，基本接近于染色體數(shù)理論值之比2∶1;而二倍體與單倍體的氣孔數(shù)比值約為1∶2.22，單倍體的氣孔數(shù)約為二倍體的2倍。單、二倍體西葫蘆的氣孔數(shù)和葉綠體數(shù)均呈顯著差異，因此可作為倍性鑒定的有效依據(jù)。

2.5 不同倍性西葫蘆氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)分布頻率

由不同倍性西葫蘆氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)分段結(jié)果(表4)可知，單倍體和二倍體西葫蘆的葉綠體數(shù)變異系數(shù)均較大，分別達(dá)到21.2%和15.8%。單倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)為3～8個(gè)，葉綠體數(shù)為4個(gè)的最多，占42.68%，4～5個(gè)的占68.29%，且葉綠體數(shù)≤6個(gè)的占95.73%;二倍體為6～13個(gè)，葉綠體數(shù)為8個(gè)的最多，占 34.75%，9～12 個(gè)的占51.83%。因此，以葉綠體數(shù)為7個(gè)作為分界指標(biāo)來判定倍性，葉綠體數(shù)小于7個(gè)為單倍體，大于或等于7個(gè)為二倍體，單、二倍體判定的準(zhǔn)確率分別達(dá)95.73%和94.51%。

圖3 西葫蘆氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)與倍性的關(guān)系

表4 西葫蘆不同倍性植株氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)的分段頻率 %

3 結(jié)論與討論

研究表明，細(xì)胞分裂素有利于芽的增殖，其中低質(zhì)量濃度6－BA的增殖效果優(yōu)于KT和ZT［18］。王家珍等［19］發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量濃度6－BA使外植體葉片卷曲甚至畸形，而低質(zhì)量濃度的6－BA能促進(jìn)外植體生長，并且葉片生長正常。宗娟等［20］的研究中，當(dāng)6－BA質(zhì)量濃度升高到1.20 mg/L時(shí)，新稍葉片卷曲畸形，且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在本試驗(yàn)中，MS+0.50 mg/L 6－BA對(duì)西葫蘆芽苗的腋芽誘導(dǎo)增殖率最高，達(dá)75.0%，當(dāng)6－BA 質(zhì)量濃度升高到1.00 mg/L 時(shí)，不利于腋芽的分化，分化的不定芽簇生，多畸形，不能用于擴(kuò)繁操作，與前人研究結(jié)果相符。另外，本試驗(yàn)在不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基上有50.0%的莖尖增殖出腋芽，增殖倍數(shù)為 1.50，王建書等［8］研究認(rèn)為，西葫蘆莖尖在基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基上雖能進(jìn)一步生根，但發(fā)育緩慢，不能促進(jìn)基部腋芽的發(fā)生，這可能是由于外植體的獲取途徑不同造成的，本試驗(yàn)所選用的莖尖來自受植物生長調(diào)節(jié)劑影響的再生胚囊植株，而王建書則直接從實(shí)生苗上截取莖尖，前期培養(yǎng)沒受到植物生長調(diào)節(jié)劑的影響。

宗娟等［20］認(rèn)為，NAA具有較好的根誘導(dǎo)效應(yīng)。趙曉菲［21］也指出，培養(yǎng)基中NAA 質(zhì)量濃度為0.05 mg/L或0.10 mg/L時(shí)胚狀體不定根發(fā)生率顯著高于不添加NAA的培養(yǎng)基，而質(zhì)量濃度超過0.10 mg/L時(shí)平均生根時(shí)間明顯延長。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NAA質(zhì)量濃度為 0.10 mg/L 時(shí)，生根率最高，達(dá)83.3%，在其他處理的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根率均較低。降低無機(jī)鹽質(zhì)量濃度配合一定的植物生長調(diào)節(jié)劑常常能解決再生苗生根難的問題［22］。例如，櫻桃在MS培養(yǎng)基上不能生根，而在1/2MS培養(yǎng)基上可形成根［23］。劉獨(dú)臣等［16］在對(duì)西瓜莖尖離體再生體系的構(gòu)建過程中發(fā)現(xiàn)，添加1/2MS+0.10 mg/L NAA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根率達(dá)100%。因此，在以后的試驗(yàn)中，將對(duì)不同質(zhì)量濃度無機(jī)鹽對(duì)腋芽的生根效果進(jìn)行比較。

染色體倍性化在遺傳育種、作物品種改良及優(yōu)良性狀利用上發(fā)揮著越來越重要的作用，倍性鑒定是倍性育種及其應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)。在眾多鑒定方法中，染色體制片法是細(xì)胞倍性鑒定最直接可靠的方法。因其計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，不需要復(fù)雜的儀器，也是目前應(yīng)用最多的鑒定方法。常規(guī)染色體制片一般采用莖尖、根尖、卷須、愈傷組織等材料［24］。郭啟高等［25］在西瓜組織培養(yǎng)早期，利用不定芽葉尖染色體計(jì)數(shù)法檢出植株倍性。王艦等［14］研究了馬鈴薯匍匐莖莖尖、塊莖莖尖和試管苗根尖不同組織的差異，發(fā)現(xiàn)塊莖的莖尖和匍匐莖的莖尖作為染色體數(shù)目鑒定材料效果都比較好。陳勁楓等［26］指出，對(duì)于卷須類種質(zhì)資源，尤其在種子缺乏、材料極其珍貴的情況下，卷須是理想的染色體研究材料。本試驗(yàn)通過對(duì)西葫蘆莖尖、根尖和卷須作為鑒定材料的效果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)根尖和卷須均可區(qū)分不同倍性材料，卷須與根尖相比，取卷須對(duì)珍貴的單倍體材料無損傷，可以作為西葫蘆根尖染色體倍性鑒定的替代材料。

雖然染色體計(jì)數(shù)法準(zhǔn)確性高，但此方法耗時(shí)而且需要熟練的細(xì)胞學(xué)操作技術(shù)［27］，而西葫蘆染色體小，染色體數(shù)目多，細(xì)胞密度大，在制片過程中細(xì)胞和染色體均易造成重疊，大批量的鑒定十分困難。葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞鑒定法，因其操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠和適合大容量樣本的倍性鑒定等特點(diǎn)，在葫蘆科作物倍性鑒定中受到廣泛重視和應(yīng)用［28-29］。如王康等［30］研究發(fā)現(xiàn)，四倍體和二倍體相比在氣孔大小、密度和葉綠體數(shù)目方面存在顯著差異，可在早期利用氣孔特征快速鑒定、排除二倍體植株。閔子揚(yáng)等［29］認(rèn)為，南瓜單倍體再生植株的保衛(wèi)細(xì)胞平均葉綠體數(shù)目為4.28個(gè)，二倍體植株平均葉綠體數(shù)為8.37個(gè)。施先鋒等［31］提出，西瓜二倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)為8～14個(gè)，四倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)為15～21個(gè)，即二倍體的葉綠體數(shù)＜15個(gè)，四倍體的葉綠體數(shù)≥15個(gè)，初步將葉綠體數(shù)15個(gè)作為鑒定西瓜二倍體和四倍體的分界指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)為7個(gè)可作為西葫蘆鑒定單二倍體的界限，葉綠體數(shù)＜7個(gè)為單倍體，準(zhǔn)確率達(dá)95.73%，葉綠體數(shù)≥7個(gè)為二倍體，準(zhǔn)確率達(dá)94.51%。本結(jié)論可能受品種及材料來源的影響，對(duì)于其他品種來源的材料是否適用還需要進(jìn)一步探究。

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，胚囊再生植株雖然可以實(shí)現(xiàn)莖尖擴(kuò)繁，但培養(yǎng)一段時(shí)間的莖尖普遍存在“花打頂”，這種現(xiàn)象嚴(yán)重影響了植株的生長，以后將在培養(yǎng)基中添加GA對(duì)“花打頂”現(xiàn)象進(jìn)行抑制，進(jìn)一步完善胚囊植株莖尖培養(yǎng)快繁技術(shù)。

［1］ 王玉書，王歡，高美玲，等.羽衣甘藍(lán)小孢子再生植株的倍性鑒定及加倍［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，44(7):107-110.

［2］ 孫守如，章鵬，胡建斌，等.南瓜未受精胚珠的離體培養(yǎng)及植株再生［J］.植物學(xué)報(bào)，2013，48(1):79-86.

［3］ 謝冰，王秀峰，樊治成.西葫蘆離體雌核發(fā)育胚狀體成苗影響因子分析［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15(5):182-186.

［4］ Shalaby T A.Factors affecting haploid induction through in vitro gynogenesis in summer squash(Cucurbita pepo L.)［J］.Scientia Horticulturae，2007，115(1):1-6.

［5］ 劉栓桃，趙智中，孫小鐳，等.西葫蘆未受精胚珠離體誘導(dǎo)植株再生的關(guān)鍵因素［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23(2):96-100.

［6］ 唐桃霞，程永安，張恩慧，等.外源添加物對(duì)西葫蘆胚狀體誘導(dǎo)效果研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24(6):84-89.

［7］ 程慧.西葫蘆離體雌核培養(yǎng)及植株再生影響因子研究［D］.楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

［8］ 王建書，孫松松，劉浩，等.西葫蘆莖尖離體培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)［J］.北方園藝，2015(22):96-98.

［9］ 鄒萬君，劉衛(wèi)民，李華，等.脫毒馬鈴薯原原種莖尖扦插快繁技術(shù)［J］.云南農(nóng)業(yè)科技，2016(3):6-8.

［10］ 王耀琴，劉建平，南懷林，等.山藥種苗3種快繁技術(shù)比較研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2016，32(16):34-39.

［11］ 張春芬，潘天任，鄧舒，等.草莓莖尖快速繁殖體系的研究［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(3):291-293.

［12］ 賈文慶，劉宇，唐米米.觀賞南瓜的組織培養(yǎng)和快速繁殖［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(1):91-93.

［13］ 宋金亮，朱磊，王震，等.低溫弱光脅迫對(duì)西葫蘆幼苗生長指標(biāo)的影響［J］.北方園藝，2017(1):13-17.

［14］ 王艦，楊永智，蒲秀琴.鑒定馬鈴薯染色體數(shù)目的方法研究［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(1):1-2.

［15］ 張菊平，鞏振輝，劉珂珂，等.辣椒染色體倍性水平的快速檢測(cè)［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，35(8):121-124.

［16］ 劉獨(dú)臣，房超，劉小俊，等.小西瓜莖尖離體再生體系的建立［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，21(5):1373-1377.

［17］ 張志忠，吳菁華，呂柳新.西瓜高頻再生系統(tǒng)的研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2004，20(2):151-153.

［18］ 張虹，洪霓，王國平.梨樹莖尖培養(yǎng)及其在病毒脫除中的應(yīng)用［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23(3):370-374.

［19］ 王家珍，蔡忠民.南果梨的莖尖培養(yǎng)［J］.北方果樹，2004(2):9-10.

［20］ 宗娟，朱立武，賈兵.黃冠梨莖尖離體培養(yǎng)再生體系建立初探［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，37(2):51-53.

［21］ 趙曉菲.西葫蘆離體雌核培養(yǎng)誘導(dǎo)胚囊再生植株技術(shù)研究［D］.楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

［22］ 陶煉，潘翠萍，謝紅江，等.三倍體枇杷莖尖培養(yǎng)與植株再生［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2014，35(11):2249-2254.

［23］ 張志勤，肖婭萍，王喆之.馬哈利櫻桃莖尖培養(yǎng)與快速繁殖［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2004，40(1):70.

［24］ 陶抵輝，李小紅，王利群，等.植物染色體倍性鑒定方法研究進(jìn)展［J］.安陽工學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，13(6):453-458.

［25］ 郭啟高，宋明，楊天秀，等.西瓜試管苗中四倍體鑒定方法研究［J］.西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2000，22(3):261-263.

［26］ 陳勁楓，錢春桃.利用幾種園藝作物卷須制片鑒定染色體數(shù)目的研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，2002，29(4):378-380.

［27］ Metwally E I，Moustafa S A，El-Sawy B I，et al.Production of haploid plants from in vitro culture of unpollinated ovules of Cucurbita pepo［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture(PCTOC)，1998，52(3):117-121.

［28］ 郭永強(qiáng)，王建設(shè)，張慧玲，等.西葫蘆胚囊再生植株倍性鑒定方法研究［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2004，19(3):80-83.

［29］ 閔子揚(yáng)，劉澤發(fā)，楊紅波，等.南瓜胚囊再生植株倍性鑒定方法的比較［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016，42(2):162-165.

［30］ 王康，何林池，魏小云，等.利用二甲戊樂靈創(chuàng)制薄皮甜瓜同源四倍體［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24(4):114-119.

［31］ 施先鋒，彭金光，汪李平.用西瓜葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)鑒定西瓜染色體倍性［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，35(6):640-642.