顧玲玲，吳 萌，朱善元，王安平

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院/江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，江蘇泰州225300)

鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由鴨甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)引起的、主要侵害3周齡以下雛鴨的一種高度接觸性致死性傳染病，1周齡以內(nèi)的雛鴨病死率可高達100%，對養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴重危害。DHAV可分為3種血清型:DHAV－Ⅰ(經(jīng)典的血清型)、DHAV－Ⅱ(新發(fā)現(xiàn)于臺灣的血清型)和DHAV－Ⅲ(新發(fā)現(xiàn)于中國和韓國的血清型)，3個血清型之間存在明顯的差異，無交叉免疫性［1-2］。

目前，我國DHAV－Ⅰ流行較普遍。DHAV－Ⅰ病毒粒子呈球形或類球形，無囊膜?；蚪M大小約7 690 bp，只編碼1個開放閱讀框(ORF)，病毒基因組編碼的多聚蛋白在病毒自身編碼的蛋白酶的作用下水解成1個結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(P1)和2個非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(P2和P3)。P1區(qū)進一步水解為VP0、VP1和VP3等3種結(jié)構(gòu)蛋白，P2區(qū)進一步水解為2A1、2A2(2A3)、2B和2C等4種或5種非結(jié)構(gòu)蛋白，P3區(qū)進一步水解為3A、3B、3C和3D等4種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，VP1蛋白為其主要的結(jié)構(gòu)蛋白，位于病毒衣殼表面，是決定病毒抗原性的主要成分［3-4］，而且VP1包含多個中和抗原表位，可誘導機體產(chǎn)生保護性中和抗體［5-7］。目前，對于DVH尚無有效的藥物治療措施，免疫接種仍是預防該病的主要措施，但普遍存在安全性低、免疫效果不夠理想等缺點，并且變異毒株的出現(xiàn)使其免疫失敗也逐漸增多，迫切需要開發(fā)DVH的新型疫苗。鑒于此，利用昆蟲細胞－桿狀病毒表達系統(tǒng)表達DHAV－ⅠSH株的VP1基因，以期表達出具有免疫原性的VP1重組蛋白，為DVH基因工程亞單位疫苗的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 毒株、菌株、載體和血清

E.coli DH5α、DH10Bac感受態(tài)細胞，草地夜貪蛾卵巢細胞Sf 9，Bac－to－Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，含有DHAV－ⅠVP1基因的重組質(zhì)粒pET－VP1，DHAV－Ⅰ全病毒陽性血清(DHAV－Ⅰ SH株免疫鴨后收集的鴨血清)，DHAV－ⅠVP1多克隆抗體(原核表達的DHAV－ⅠVP1蛋白免疫小鼠后制備)均由江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室保存。

1.2 主要工具酶和試劑

轉(zhuǎn)染試劑CellfectinⅡ Reagent購自Invitrogen公司;T4 DNA連接酶，pfu DNA聚合酶，限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ、BamHⅠ 均購自Thermo公司;昆蟲細胞培養(yǎng)基 Sf－900ⅡSFM購自 GBICO公司;SDSPAGE凝膠制備試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司;FITC標記的羊抗鴨IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG均購自Southern Biotech公司。

1.3 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的DHAV－Ⅰ SH株VP1基因序列設計1對特異性引物，分別在上下游引物的5'端引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點。用于擴增DHAV－ⅠVP1基因的PCR引物序列為VP1－F:5'－TAAGGATCC ACCATGGGTGATTCCAACCAGTTGGGG－3'(下劃線為 BamHⅠ酶切位點)，VP1－R:5'－CGACCTCGAGTTATTCAATTTCCAGATTAAGTTC－3'(下劃線為XhoⅠ酶切位點)。預期擴增片段大小為714 bp。用于桿狀病毒質(zhì)粒同源重組鑒定的通用引物 M13－F/M13－R 序列參照 Bac－to－Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)使用說明設計。引物均由上海生工生物技術有限公司合成。

1.4 VP1 基因擴增

以重組質(zhì)粒pET－VP1為模板進行PCR擴增。50 μL 反應體系:模板 1 μL、10×Buffer 5 μL、VP1－F 2 μL、VP1－R 2 μL、dNTP 5 μL、pfu DNA 聚合酶1 μL、去離子水 34 μL。反應程序:94 ℃ 預變性3 min;94℃變性20 s，51℃退火20 s，72℃延伸 90 s，30個循環(huán);72℃延伸7 min，4℃保存。

1.5 重組轉(zhuǎn)移載體pFB－VP1的構(gòu)建

將回收的VP1 PCR產(chǎn)物及桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1分別用XhoⅠ和BamHⅠ酶切后回收，T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)15 h。隨機挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。以過夜菌為模板，以VP1－F和VP1－R為上、下游引物進行PCR擴增，將PCR初步鑒定為陽性的菌株提取質(zhì)粒，用XhoⅠ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定，并送上海英濰捷基生物技術有限公司測序。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pFB－VP1。

1.6 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的制備

根據(jù)Bac－to－Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)操作說明，將重組質(zhì)粒pFB－VP1轉(zhuǎn)化至 E.coli DH10Bac感受態(tài)細胞進行同源重組，取菌液均勻涂布于含卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X－Gal及 IPTG的 LB平板上，37℃培養(yǎng)48 h。隨機挑取數(shù)個白色菌落，過夜培養(yǎng)后，堿裂法提取重組Bacmid DNA。用通用引物M13－F/M13－R進行PCR鑒定，反應體系及反應程序均參照Bac－to－Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)操作說明書進行，將鑒定正確的陽性重組穿梭質(zhì)粒命名為rBacmid－VP1。在平板上挑取藍色菌落，過夜培養(yǎng)后，堿裂解法提取未重組的Bacmid DNA，即為野生型Bacmid DNA。

1.7 重組桿狀病毒rBac－VP1的制備

參照CellfectinⅡReagent轉(zhuǎn)染說明，將rBacmid－VP1和野生型Bacmid DNA分別轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的Sf 9昆蟲細胞。約72 h后，待細胞出現(xiàn)明顯病變，收集細胞液，500 r/min離心5 min，獲得的上清即為P1代重組桿狀病毒rBac－VP1。同樣參照Bac－to－Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)操作說明書，將P1代重組桿狀病毒在Sf 9昆蟲細胞上進行擴增至P3代，空斑試驗測定P3代rBac－VP1的病毒滴度。

1.8 重組蛋白VP1的間接免疫熒光鑒定

為檢測重組蛋白VP1的表達情況，將Sf 9昆蟲細胞以6×105個/孔的量鋪于24孔板。分別以不同的感染復數(shù)(MOI)感染P3代rBac－VP1及野生型桿狀病毒，待細胞出現(xiàn)明顯的病變(約感染72 h后)，棄去培養(yǎng)基，用預冷的固定液(V丙酮∶V乙醇=3∶2)固定5 min，棄去固定液;PBS洗滌2遍后加入5%BSA室溫封閉1 h;再加入1∶100稀釋的DHAV－Ⅰ全病毒陽性血清，37℃孵育1 h;PBST洗滌5遍后加入1∶500稀釋 FITC標記的羊抗鴨 IgG，37℃孵育30 min;PBST洗滌3遍后在熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.9 重組蛋白VP1的Western blot分析

將P3代rBac－VP1及野生型桿狀病毒分別以不同的MOI感染處于對數(shù)生長期的Sf 9昆蟲細胞，待細胞出現(xiàn)明顯的病變(約感染72 h后)，500 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，加入 5×Loading Buffer，煮沸3 min，取15 μL進行 SDS－PAGE分析。樣品電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，以DHAV－ⅠVP1多克隆抗體為一抗、HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，經(jīng)DAB顯色后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP1基因的擴增結(jié)果

將VP1 PCR產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1條約714 bp的條帶(圖1)，與預期條帶大小一致。

圖1 VP1基因片段的PCR擴增結(jié)果

2.2 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFB－VP1的構(gòu)建與鑒定

將回收的目的基因VP1與載體pFastBac1連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR篩選獲得重組子。XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，產(chǎn)生與預期大小一致的2條約714 bp和4 800 bp的條帶(圖2)，表明VP1基因已成功克隆入載體pFastBac1中，成功構(gòu)建了重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFB－VP1。

2.3 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid－VP1的鑒定

以通用引物M13－F/M13－R對重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒DNA進行鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物片段大小約3 000 bp，與預期條帶大小一致(圖3)，表明成功制備了重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒 rBacmid－VP1 。

圖2 重組質(zhì)粒pFB－VP1的雙酶切鑒定結(jié)果

圖3 重組穿梭質(zhì)粒rBacmid－VP1的PCR鑒定結(jié)果

2.4 重組蛋白VP1的間接免疫熒光檢測結(jié)果

以DHAV－Ⅰ全病毒陽性血清為一抗對昆蟲細胞中的重組蛋白進行間接免疫熒光檢測。結(jié)果顯示，rBac－VP1感染的昆蟲細胞有大量特異性綠色熒光，而在野生型桿狀病毒感染的昆蟲細胞內(nèi)則未觀察到(圖4)，說明在昆蟲細胞中成功表達了重組蛋白VP1，且表達的重組蛋白具有免疫原性。

圖4 重組蛋白VP1的間接免疫熒光檢測(400×)

2.5 重組蛋白VP1的Western blot分析

為鑒定重組蛋白的分子質(zhì)量，以DHAV－ⅠVP1多克隆抗體為一抗進行Western blot分析。結(jié)果顯示，在分子質(zhì)量約27 ku處出現(xiàn)了特異性條帶，與預期條帶大小一致，而野生型桿狀病毒感染則未出現(xiàn)特異條帶(圖5)。

圖5 重組蛋白VP1的Western blot分析

3 結(jié)論與討論

目前，常用的外源基因表達系統(tǒng)主要包括原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)。其中，原核表達系統(tǒng)雖然能夠進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，但大腸桿菌不能對表達產(chǎn)物進行翻譯后加工，生產(chǎn)的重組蛋白一般沒有活性，限制了該系統(tǒng)的應用［8-10］。酵母表達系統(tǒng)作為一種真核表達系統(tǒng)，雖然能進行翻譯后加工，但往往存在過糖基化的缺點，且重組蛋白的表達量也較低［11］。Bac－to－Bac 桿狀病毒系統(tǒng)是 Luckow 等［12］在1993年研究成功的一種快速高效生產(chǎn)重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV)的表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有真核生物蛋白質(zhì)翻譯后加工所需要的酶系統(tǒng)，能夠?qū)Ρ磉_產(chǎn)物進行適當?shù)姆g后修飾，生產(chǎn)的重組蛋白的抗原性、酶活力等生物學活性與天然蛋白十分接近［13-14］，已成為病毒疫苗研究和商業(yè)產(chǎn)業(yè)化的平臺［15］。因此，本研究選用桿狀病毒/昆蟲細胞系統(tǒng)作為DHAV－Ⅰ VP1基因的表達系統(tǒng)。Western blot鑒定結(jié)果顯示，昆蟲細胞中表達的蛋白能夠被DHAV－ⅠVP1多克隆抗體特異性識別，證明成功表達了重組蛋白VP1，且大小與預期相符;間接免疫熒光檢測結(jié)果顯示，表達的重組蛋白VP1能與DHAV－Ⅰ全病毒陽性血清發(fā)生特異性反應，說明該重組蛋白具有良好的反應原性。

本研究采用SDS－PAGE對重組蛋白進行檢測，與野生型桿狀病毒感染組相比，未能觀察到明顯的目的條帶(數(shù)據(jù)未顯示)，說明重組蛋白的表達量不高，分析其原因，在利用外源系統(tǒng)表達目的蛋白時需要考慮密碼子的適應性。據(jù)報道，密碼子適應指數(shù)(CAI)接近 1.0 時［16］，蛋白質(zhì)表達水平較高，許多研究者通過優(yōu)化密碼子實現(xiàn)了對目的基因的高效表達。為提高重組蛋白在昆蟲細胞中的表達水平，后續(xù)試驗將對VP1基因的密碼子進行優(yōu)化，以提高VP1的表達量，促進其進一步應用。

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