馮穎杰，王鵬飛，陳芝飛，楊宗燦* ，李家美，張 展，王根發(fā)

(1.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南鄭州450000;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002)

淀粉是煙草生長過程中積累的重要碳水化合物，廣泛存在于煙草的莖葉中［1］，其含量的高低與煙葉的品質(zhì)密切相關(guān)［2］。淀粉含量過高影響煙草制品的抽吸品質(zhì)，一方面會影響燃吸的速度和完全性［3-4］，另一方面淀粉在燃燒時會產(chǎn)生焦糊氣味以及多種有害成分，對煙草制品的色、香、味產(chǎn)生不良影響［5-6］。國外優(yōu)質(zhì)煙葉的淀粉含量一般為 l%～2%［7］，而我國煙葉的淀粉含量為 4% ～6%［8］，烤煙淀粉含量普遍偏高，已成為制約我國煙葉質(zhì)量提高的重要因素之一。因此，利用適宜的方法將煙葉中的淀粉降解成還原糖等小分子物質(zhì)，是提高煙葉品質(zhì)的有效途徑之一［9-10］。但單純依賴煙草自身酶類的水解作用遠不能滿足卷煙工業(yè)對高品質(zhì)煙葉原料的需求［11］，如何利用生物技術(shù)途徑降低煙葉的淀粉含量，從而提高煙葉品質(zhì)，已成為科技工作者普遍關(guān)注的問題。

生物法降解煙葉淀粉的研究主要為酶制劑法和微生物法［12］，后者以其成本低廉、操作簡單等優(yōu)勢成為研究熱點［13］。然而，微生物法降解煙葉淀粉大多存在著菌株產(chǎn)酶活性不高、淀粉降解率偏低的問題;雖然也有學(xué)者通過先發(fā)酵再降解煙葉淀粉的方式獲得了較高的淀粉降解率，但是復(fù)雜的操作方式、較長的工藝周期制約著其在煙草工業(yè)中的應(yīng)用［14］。因此，選育出能夠直接應(yīng)用于煙草發(fā)酵并能高效降解煙葉淀粉的菌株具有重要意義。鑒于此，本研究從河南、福建、云南等不同產(chǎn)地的原煙表面篩選能夠高效降解煙葉淀粉的菌株，對其進行鑒定后將其直接施加于抽梗后的煙葉表面，以煙葉淀粉降解率為指標(biāo)，采用正交試驗確定該菌株作用于煙葉的最適條件，旨在為高效降解煙葉淀粉菌株應(yīng)用于煙草工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試煙葉 菌株篩選所用煙葉:2015年河南許昌B2F、2015年河南三門峽B2F、2015年福建三明C2F、2015年福建南平 C3F、2015年云南楚雄B3F、2015年云南臨滄B2F。篩選菌株降解煙葉淀粉效果驗證所用煙葉:2015年河南許昌B2F。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g/L、蛋白胨 10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L，pH 值 7.0～7.2。

初篩培養(yǎng)基:牛肉膏 5.0 g/L、蛋白胨 10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、可溶性淀粉 20.0 g/L、瓊脂粉 15.0 g/L，pH 值 7.0～7.2。

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 值 7.0;LB 固體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂粉。

YEPD培養(yǎng)基:酵母膏 10 g/L、蛋白胨 20 g/L、葡萄糖20 g/L。

種子培養(yǎng)基:牛肉膏 5.0 g/L、蛋白胨 10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L，pH 值 7.0～7.2。

復(fù)篩培養(yǎng)基:可溶性淀粉 20.0 g/L、豆粕粉20.0 g/L，pH 值 7.0～7.2。

以上培養(yǎng)基均在1×105Pa滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的初步分離 取1 g粉碎后的煙葉末，在無菌環(huán)境下置入裝有50 mL已滅菌富集培養(yǎng)基的搖瓶中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液按照 10－2、10－3、10－4梯度稀釋后涂布于 LB 平板和YEPD平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，挑選單菌落，通過四區(qū)劃線法進一步分離單菌落，試管斜面保存菌株。

1.2.2 菌株初篩 保存的菌株采用點種法接種于初篩培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)72 h，選取產(chǎn)生透明圈的菌株，測量透明圈和菌落的直徑，計算比值。

1.2.3 菌株復(fù)篩 將透明圈與菌落直徑比值大的菌株接種于10 mL種子培養(yǎng)基，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，分別取1.5 mL菌液接種至50 mL復(fù)篩培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)72 h獲得發(fā)酵液;將發(fā)酵液于8 000 r/min離心5 min，取上清液測定淀粉酶活性。選擇淀粉酶活性最大的菌株作為后續(xù)試驗菌株。

淀粉酶活性的測定參照王瑞新等［15］的方法。淀粉酶的活性定義為:將1 min催化分解淀粉生成1 mg麥芽糖所需酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.2.4 菌株的形態(tài)特征及生理生化鑒定 將篩選到的淀粉酶高產(chǎn)菌株轉(zhuǎn)接到LB固體平板上，于37℃培養(yǎng)48 h，觀察、記錄菌落特征并進行顯微鏡涂片觀察。參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和“芽孢桿菌屬(Bacillus)二分檢索表”，對菌株進行生理生化鑒定。

1.2.5 菌株16S rDNA序列分析 設(shè)計通用引物，以所選菌株的總DNA為模板擴增菌株16S rDNA，由上海生工生物工程有限公司測序，通過BLAST比對搜索同源性較高的序列，利用DNAMAN軟件進行進化樹分析。

1.2.6 篩選菌株降解煙葉淀粉的作用效果考察以2015年河南許昌B2F煙葉為試驗對象，噴灑種子液(OD600=2.0)于煙葉表面，進行恒溫恒濕條件下發(fā)酵。以淀粉含量為依據(jù)，優(yōu)化所選菌株降解煙葉淀粉的條件。分別對菌株發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量進行單因素試驗，確定發(fā)酵條件的大致范圍。然后根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計正交試驗，對發(fā)酵條件進一步優(yōu)化，確定最終發(fā)酵條件。以未經(jīng)過菌株處理的正常煙葉為對照，比較發(fā)酵前后煙葉的淀粉、總糖、還原糖、蛋白質(zhì)、總氮、煙堿含量，驗證發(fā)酵條件優(yōu)化后的效果。

煙葉常規(guī)化學(xué)成分含量的測定參照王瑞新等［15］的方法，煙葉淀粉含量的測定參照《煙草及煙草制品淀粉的測定連續(xù)流動法》(YC/T 216—2013)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉中產(chǎn)淀粉酶菌株初篩結(jié)果

從河南、福建、云南3個產(chǎn)地的原煙表面共分離獲得123株菌株，用淀粉培養(yǎng)基篩選得到22株產(chǎn)淀粉酶的菌株。進一步驗證表明:淀粉酶生產(chǎn)菌株XC－3、CX－19、SM－22和 NP－13等 4株細菌透明圈與菌落的直徑比值較大，分別為 3.7、1.8、1.4、1.7(圖1)，其中以菌株XC－3透明圈最大，且透明圈與菌落的直徑比值最大。故選擇4株淀粉酶產(chǎn)生菌進行淀粉酶活力測定。

圖1 淀粉酶產(chǎn)生菌在淀粉酶篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈及其生長情況

2.2 煙葉中高產(chǎn)淀粉酶菌株的復(fù)篩結(jié)果

4株淀粉酶產(chǎn)生菌發(fā)酵后的淀粉酶活力如表1所示。表1表明:4株淀粉酶產(chǎn)生菌酶活力分別為116、92、48、64 U/mL，其中菌株 XC－3 的淀粉酶活力最大，與2.1中的初篩試驗結(jié)果一致，故選擇XC－3作為煙葉發(fā)酵降解淀粉的候選菌株。

表1 4株淀粉酶產(chǎn)生菌的淀粉酶活力

2.3 菌株XC－3的形態(tài)特征

分離得到的菌株XC－3經(jīng)平板培養(yǎng)48 h后，菌落呈圓形，透明，濕潤，表面黏狀，直徑約3 mm，邊緣整齊。油鏡觀察顯示，菌株呈桿狀(圖2)，革蘭氏染色顯示為陽性。

圖2 菌株XC－3顯微照片(100×)

2.4 菌株XC－3的16S rDNA序列測定結(jié)果及進化關(guān)系分析

以菌株XC－3的基因組DNA為模板，16S rDNA引物擴增出1條長度為1 414 bp的片段，其測序結(jié)果通過比對分析后，構(gòu)建菌株進化樹。結(jié)果表明，在前100個搜索結(jié)果中，XC－3與芽孢桿菌屬的相似性均達90%以上，與蘇云金芽孢桿菌的相似性達100%(圖3)。結(jié)合生理生化特征(表2)推斷，產(chǎn)淀粉酶菌株 XC－3為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。

圖3 菌株XC－3的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

表2 菌株XC－3的生理生化試驗結(jié)果

2.5 菌株XC－3發(fā)酵煙葉的條件優(yōu)化

在單因素試驗條件下初步確定菌株XC－3發(fā)酵煙葉的最適發(fā)酵時間為 48 h，最適發(fā)酵溫度為37℃，最佳接種量為3%。以此為依據(jù)設(shè)計L9(33)正交試驗(表3)，L9(33)正交試驗的方案和極差分析結(jié)果見表4。

表3 L9(33)正交試驗因素和水平

表4 L9(33)正交試驗極差分析結(jié)果

從表4可知，菌株XC－3發(fā)酵煙葉條件的最優(yōu)水平組合為A2B3C3，即發(fā)酵時間為48 h、發(fā)酵溫度為37℃、接種量為3%。通過R值比較可知:RA＞RC＞RB，即發(fā)酵時間對發(fā)酵結(jié)果的影響最大，其次是接種量，而發(fā)酵溫度的影響最小。

由于最優(yōu)化組合并不在9組正交處理方案中，因此對優(yōu)化處理方案進行驗證試驗，結(jié)果表明，發(fā)酵后煙葉的淀粉含量為4.68%，與未經(jīng)過菌株處理的煙葉(淀粉含量為6.67%)相比，降解率達29.84%。

2.6 發(fā)酵前后煙葉的常規(guī)化學(xué)成分含量比較

按照正交試驗得出的最優(yōu)處理方案A2B3C3(發(fā)酵時間為48 h、發(fā)酵溫度為 37℃、接種量為3%)對煙葉進行發(fā)酵處理，測定其常規(guī)化學(xué)成分，結(jié)果如表5所示。由表5可見，河南許昌煙葉B2F經(jīng)蘇云金芽孢桿菌XC－3發(fā)酵處理后，總糖含量增加了17.1%，還原糖含量增加了13.1%，說明煙葉經(jīng)過菌株XC－3發(fā)酵處理后，煙葉中的淀粉等大分子物質(zhì)有效降解生成了可溶性糖。總氮和煙堿含量變化不大。此外，煙葉發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量略有下降，可見XC－3菌株對煙葉蛋白質(zhì)也有一定的降解能力，有助于煙葉品質(zhì)的提升。

表5 發(fā)酵前后煙葉的常規(guī)化學(xué)成分含量 %

3 結(jié)論與討論

圍繞利用微生物技術(shù)降低煙葉淀粉含量，科技工作者做了大量的研究。胥海東［16］篩選出1株產(chǎn)酶較高的枯草芽孢桿菌，最高酶活性為55.89 U/mL，發(fā)酵后噴施于煙葉，其淀粉降解率為11.49%;趙銘欽等［17］從煙葉中篩選出巨大芽孢桿菌，經(jīng)過紫外誘變選育后對菌株發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶，活性為2.821～3.273 U/mL，但未進行對煙葉淀粉降解的驗證;余玉莎等［18］把煙葉碎成煙末，利用米根霉發(fā)酵7 d后，煙末中淀粉含量降低20.6%。而本研究從不同產(chǎn)地初烤原煙表面分離篩選煙葉淀粉降解菌株，從分離到的123株菌株中獲得22株產(chǎn)淀粉酶菌株，通過復(fù)篩，最終得到1株高效淀粉酶產(chǎn)生菌XC－3，酶活力高達116 U/mL;對其進行16S rDNA序列比對及進化關(guān)系分析，并結(jié)合菌株的形態(tài)和生理生化試驗結(jié)果，推斷XC－3為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis);將菌液(OD600=2.0)直接作用于煙葉表面，37℃下經(jīng)過48 h發(fā)酵后，煙葉中淀粉的降解率高達29.84%，煙葉中總糖、還原糖含量均有所上升?？梢姡瑹熑~經(jīng)過XC－3菌株處理后，可有效促進淀粉向可溶性糖類等小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

通過對比以往研究發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的XC－3菌株在產(chǎn)酶活力以及作用煙葉后的淀粉降解率等方面均有較為明顯的優(yōu)勢，可有效提升煙葉整體品質(zhì)。同時，在以往研究中，用于煙葉淀粉降解的菌株大多為枯草芽孢桿菌、米根霉等，鮮有蘇云金芽孢桿菌用于煙葉淀粉降解的報道，本研究為煙草淀粉的微生物降解提供了新的菌株資源選擇。在煙葉淀粉發(fā)酵降解方式的選擇上，以往研究大多通過先發(fā)酵后噴施的方式，無疑增加了工藝成本，而本研究采用直接噴施菌株種子液的發(fā)酵方式，工藝簡單、成本低廉。

為進一步改善煙葉質(zhì)量，應(yīng)在保證煙葉香氣成分和加工性能的基礎(chǔ)上，針對煙葉蛋白質(zhì)、纖維素和果膠等關(guān)鍵物質(zhì)持續(xù)開展更系統(tǒng)、更全面的研究，可探索通過混菌發(fā)酵的方式實現(xiàn)煙葉中多種組分的同時降解，后期還應(yīng)通過感官評吸的方式進行更系統(tǒng)的應(yīng)用驗證研究。

［1］ 羅丹，吳俊，全學(xué)軍，等.淀粉類酶降解烤煙中淀粉的研究［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016，30(7):64-68.

［2］ 王懷珠，楊煥文，郭紅英，等.不同烘烤條件下煙葉淀粉降解酶活性變化［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005(6):30-33.

［3］ 王瑞新.煙草化學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

［4］ Weeks W W.Chemistry of tobacco constituents influence flavor and aroma［J］.RecentAdvanceofTobacco Science，1985(11):175-200.

［5］ Green C R，Rodgman A.The tobacco chemists research conference:A halfcentury forum foradvances in analytical methodology of tobacco and its products［J］.Recent Advances in Tobacco Science，1996，22(1):131-306.

［6］ Leffingwell J C.Chemical and sensory aspects of tobacco flavor—An overview［J］.Rec Adv Tob Sci，1988，14:169-218.

［7］ 齊雪峰.煙草中淀粉成分的研究及其對煙草的影響［D］.上海:上海交通大學(xué)，2008.

［8］ 賀帆，王濤，王梅，等.烤煙煙葉淀粉顆粒結(jié)構(gòu)特征與基本特性［J］.中國煙草學(xué)報，2013，19(3):49-53.

［9］ 劉雷，黃立棟.變黃階段溫度和空氣相對濕度對煙葉淀粉含量的影響［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(6):46-48.

［10］ 王曉賓，孫福山，王松峰，等.烤煙中淀粉的影響因素及其調(diào)控研究進展［J］.中國煙草科學(xué)，2008，29(2):53-57.

［11］ 段麗斌，崔國民，趙昶靈，等.烤煙烘烤中煙葉淀粉降解的研究進展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2013，29(18):180-186.

［12］ 趙銘欽，李芳芳.微生物和酶學(xué)技術(shù)在煙草發(fā)酵中的應(yīng)用及展望［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23(1):314-318.

［13］ 雷麗萍，郭榮君，繆作清，等.微生物在煙草生產(chǎn)中應(yīng)用研究進展［J］.中國煙草學(xué)報，2006，12(4):47-51.

［14］ 李少鵬.利用生物技術(shù)降解煙葉淀粉和蛋白質(zhì)含量研究［D］.鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［15］ 王瑞新，韓富根，楊素勤，等.煙草化學(xué)品質(zhì)分析法［M］.鄭州:河南科學(xué)出版社，1990.

［16］ 胥海東.枯草芽孢桿菌降解片煙中淀粉和蛋白質(zhì)的研究［D］.武漢:湖北工業(yè)大學(xué)，2011.

［17］ 趙銘欽，李曉強，王豹祥，等.α－淀粉酶和蛋白酶高產(chǎn)菌株的誘變選育［J］.煙草科技，2008(8):53-57.

［18］ 余玉莎，孫媛，李祖紅，等.米根霉發(fā)酵對煙葉常規(guī)成分及主要致香成分的影響［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2017，32(2):189-195.