覃俊奇，韋信賢，黎小正，吳祥慶，蘭宗寶，楊慧贊，黃國(guó)秋，黃鸞玉，陳 靜，童桂香*

(1.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西南寧530021;2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技信息研究所，廣西南寧530007)

龜鱉產(chǎn)業(yè)是廣西漁業(yè)的特色產(chǎn)業(yè)和新興產(chǎn)業(yè)，是農(nóng)民增收致富的重要途徑，主要養(yǎng)殖品種有廣西擬水龜、安布閉殼龜、緬甸陸龜、黃沙鱉、山瑞鱉等［1］。根據(jù)《廣西龜鱉資源調(diào)查》項(xiàng)目的統(tǒng)計(jì)，2013年廣西全區(qū)規(guī)模養(yǎng)殖戶(hù)達(dá)9.83萬(wàn)戶(hù)，產(chǎn)量2.82萬(wàn)t，全國(guó)排名第8位;產(chǎn)值78億元，全國(guó)排名第7位［2-3］。近幾年，隨著人們對(duì)龜鱉寵養(yǎng)和藥膳保健需求的不斷增加，龜鱉市場(chǎng)交易相當(dāng)活躍，產(chǎn)品價(jià)格也持續(xù)居高，龜鱉養(yǎng)殖效益喜人，致使廣西龜鱉養(yǎng)殖隊(duì)伍仍在不斷壯大。然而，在高效經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，養(yǎng)殖戶(hù)過(guò)于注重龜鱉的生長(zhǎng)速度而忽視了對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的保護(hù)及各類(lèi)疾病的防治，加上多數(shù)養(yǎng)殖戶(hù)沒(méi)有水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖的相關(guān)知識(shí)，導(dǎo)致龜鱉疾病如白眼病、肺炎、紅底板病等細(xì)菌性疾病在龜鱉養(yǎng)殖中常有發(fā)生［4-6］;養(yǎng)殖戶(hù)在龜鱉發(fā)病初期因救龜鱉心切，常不經(jīng)確診和藥敏試驗(yàn)就盲目地按經(jīng)驗(yàn)使用抗菌藥進(jìn)行治療，效果多不理想，往往會(huì)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。為了解引起廣西龜鱉細(xì)菌性疾病的病原菌種類(lèi)及其藥敏特性，對(duì)2015—2016年來(lái)自廣西各地的龜鱉病例進(jìn)行病原菌的分離與純化，并采用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)結(jié)合16S rDNA測(cè)序進(jìn)行各病原菌的鑒定，同時(shí)采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定各病原菌對(duì)頭孢曲松、鏈霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星等常用抗菌藥的敏感性，旨在為龜鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)中細(xì)菌性疾病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源

2015—2016年來(lái)自廣西南寧市、來(lái)賓市、欽州市等地共63例龜鱉病例，包括廣西擬水龜(石龜)、安布閉殼龜、緬甸陸龜、中華草龜、鱷龜、黃沙鱉、山瑞鱉和珍珠鱉共8個(gè)品種。

1.2 主要試劑與儀器

血平板、革蘭氏染色液、藥敏試紙購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;腦心浸液瓊脂(BHIA)、營(yíng)養(yǎng)肉湯、LB肉湯、LB瓊脂等培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)預(yù)混液 2×Taq PCR Master Mix(含 Taq酶、dNTPs、MgCl2等)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物有限公司;pMD18－T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、氨芐青霉素購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;細(xì)菌16S rDNA的PCR引物是William等［7］報(bào)道的通用引物 fD1(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和rP2(5'－ACGGCTACCTTGTTACGACTT－3')，由寶生物工程(大連)有限公司合成。BIOLOG自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)(包括濁度儀、細(xì)菌培養(yǎng)板、瓊脂培養(yǎng)基、接種液、接種棒、棉簽、V形加樣槽等)為美國(guó)BIOLOG公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離與純化 用75%的乙醇消毒患病龜鱉體表，無(wú)菌條件下從腐皮、肝、肺、腎等取樣劃線(xiàn)接種于血平板或BHIA平板，置30℃恒溫培養(yǎng)16～24 h;選取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)、涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌落形態(tài)特征、細(xì)菌的形態(tài)和染色特征。

1.3.2 細(xì)菌的保種與復(fù)蘇 挑取純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于30℃恒溫培養(yǎng)16～24 h，加20%甘油分裝后于－80℃保種。復(fù)蘇時(shí)將保存的菌種置于冰上15 min，用接種環(huán)無(wú)菌挑取凍存管內(nèi)的少量菌液在血平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)16～24 h。

1.3.3 細(xì)菌BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)鑒定 參照童桂香等［8］的方法進(jìn)行，具體操作如下:將細(xì)菌純培養(yǎng)后進(jìn)行革蘭氏染色及氧化酶試驗(yàn)，以選擇合適的培養(yǎng)基和細(xì)菌培養(yǎng)板;取純化培養(yǎng)的單菌落劃“十”字接種于瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)16～24 h;用接種棒挑取“十”字四邊外半部分的菌落，在滅菌的試管內(nèi)將菌落均勻分散;吸取3～5 mL接種液將試管內(nèi)分散好的菌落洗下并混合均勻，制備細(xì)菌懸濁液;用濁度儀將細(xì)菌懸濁液調(diào)至合適的濁度，靜置5 min后傾入V形加樣槽，保留最后的1 mL菌懸液在試管中;在細(xì)菌培養(yǎng)板中每孔加入150 μL菌懸液，置于濕盒中在最適溫度培養(yǎng)16～24 h;取出細(xì)菌培養(yǎng)板，觀察結(jié)果并運(yùn)用Biolog Microlog 24.2軟件分析，鑒定細(xì)菌種屬。

1.3.4 細(xì)菌16S rDNA鑒定 將純化培養(yǎng)的細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)16～24 h，離心收集細(xì)菌，用細(xì)菌DNA提取試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作提取總DNA。在PCR反應(yīng)管中分別加入2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物 fD1、rP2(50 μmol/L) 各1 μL，細(xì)菌 DNA 2 μL，加滅菌 DEPC 水至 50 μL;短暫離心后置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增:95℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 60 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳用凝膠回收試劑盒回收純化，取純化的PCR產(chǎn)物與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定;將陽(yáng)性克隆送大連寶生物工程有限公司測(cè)序，所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST檢索比較分析。

1.3.5 藥敏試驗(yàn) 采用K－B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行分離菌株對(duì)氨芐青霉素、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、紅霉素、鏈霉素、阿米卡星、卡那霉素、慶大霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素、氯霉素、復(fù)方新諾明、氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、林可霉素、多黏菌素B、磷霉素、萬(wàn)古霉素、特治星、特美汀和舒普深共27種常用抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)，并參照CLSI抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［9］判定各菌株對(duì)供檢藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西龜鱉病例致病菌檢測(cè)結(jié)果

63例龜鱉病例經(jīng)細(xì)菌分離，從其中的38例樣品中分離到48株病原菌，7例病例分離到2種或以上的病原菌，25例沒(méi)有分離到細(xì)菌，細(xì)菌檢出率為60.3%(38/63);48株病原菌經(jīng)BIOLOG自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)或16S rDNA擴(kuò)增、克隆(圖1)及測(cè)序鑒定，其中包括嗜水氣單胞菌10株、肺炎克雷伯菌8株、變形桿菌7株、溫和氣單胞菌4株、弗氏檸檬酸桿菌3株、陰溝腸桿菌3株、摩氏摩根菌3株、大腸桿菌3株、遲緩愛(ài)德華菌2株、塞氏檸檬酸桿菌2株、簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌2株和棲木槿假單胞菌1株(表1);部分菌株16S rDNA序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù):嗜水氣單胞菌(KP091884)、肺炎克雷伯菌(KP091885、KP091888)、弗氏檸檬酸桿菌(KP091886)、遲緩愛(ài)德華菌(KP091887)。

圖1 分離菌16S rDNA及其重組質(zhì)粒pMD18－T－16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

表1 廣西龜鱉疾病細(xì)菌性病原調(diào)查結(jié)果

2.2 廣西龜鱉病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

采用K－B紙片擴(kuò)散法測(cè)定了分離的48株病原菌對(duì)氨芐青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明和恩諾沙星等27種抗菌藥的藥敏特性，結(jié)果見(jiàn)表2。各病原菌表現(xiàn)出不同的耐藥譜，但均存在多重耐藥性;其中對(duì)特治星的敏感率最高，達(dá)58.3%，其次是頭孢曲松和米諾環(huán)素，均為52.1%，最低的是多黏菌素 B，為 6.3%;對(duì)四環(huán)素的耐藥率最高，達(dá)85.4%，其次是多黏菌素B，為70.8%，最低的是頭孢曲松，為14.6%(表 2)。

表2 廣西龜鱉病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2 廣西龜鱉病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

對(duì)2015—2016年來(lái)自廣西南寧市、來(lái)賓市、欽州市等地共63例龜鱉病例進(jìn)行了細(xì)菌性病原檢測(cè)，從其中的38例樣品中分離到包括嗜水氣單胞菌、肺炎克雷伯菌、變形桿菌、溫和氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌、摩氏摩根菌、大腸桿菌、遲緩愛(ài)德華菌、塞氏檸檬酸桿菌、簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌和棲木槿假單胞菌共12種48株病原菌，7例病例分離到2種或以上的病原菌，細(xì)菌檢出率為60.3%;其中，嗜水氣單胞 菌［6，10-14］、肺 炎 克 雷 伯 菌［5］、溫 和 氣 單 胞菌［10，15-17］、摩氏摩根菌［18］和塞氏檸檬酸桿菌［19］已從廣西養(yǎng)殖的龜鱉中分離到，但變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌、大腸桿菌、遲緩愛(ài)德華菌、簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌和棲木槿假單胞菌分離自廣西養(yǎng)殖的龜鱉為首次報(bào)道。此外，黎小正等［20］從廣西某養(yǎng)龜場(chǎng)的黃喉擬水龜中分離到松鼠葡萄球菌，羅華平等［21］從廣西某養(yǎng)鱉場(chǎng)的黃沙鱉幼鱉中分離到類(lèi)志賀鄰單胞菌;而未見(jiàn)從廣西養(yǎng)殖的龜鱉中分離到病毒的文獻(xiàn)，也未見(jiàn)有寄生蟲(chóng)引起龜鱉大量死亡的報(bào)道。說(shuō)明廣西龜鱉疾病仍以細(xì)菌性疾病為主，且病原復(fù)雜、存在混合感染;病原菌多為條件性致病菌，以嗜水氣單胞菌、肺炎克雷伯菌和變形桿菌為主。因此，龜鱉養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)遵循各種龜鱉的生長(zhǎng)特征及習(xí)性，不斷提高繁殖養(yǎng)殖技術(shù)，避免近親繁殖，做好種質(zhì)資源保護(hù)，堅(jiān)決杜絕“拔苗助長(zhǎng)”式養(yǎng)殖;同時(shí)，不斷加強(qiáng)養(yǎng)殖環(huán)境的保護(hù)和提高預(yù)防病害的意識(shí)，大力推廣仿生態(tài)健康養(yǎng)殖觀念及養(yǎng)殖技術(shù)，減少各種疾病的發(fā)生。

目前，使用各種抗菌素類(lèi)藥物抑制或者殺滅致病菌仍是防治細(xì)菌性疾病最有效的手段。抗菌藥對(duì)龜鱉細(xì)菌性傳染病的治療和控制起到了非常重要的作用［22］，但養(yǎng)殖過(guò)程中不科學(xué)地使用抗菌藥，極易造成致病菌產(chǎn)生耐藥性。本研究進(jìn)行了48株龜鱉病原菌對(duì)27種抗菌藥的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，各病原菌都存在嚴(yán)重的多重耐藥性，對(duì)四環(huán)素的耐藥率最高(85.4%)，其次是多黏菌素 B(70.8%)，最低的是頭孢曲松(14.6%)。有文獻(xiàn)報(bào)道，分離自廣西養(yǎng)殖龜鱉的嗜水氣單胞菌、肺炎克雷伯菌、溫和氣單胞菌、摩氏摩根菌和塞氏檸檬酸桿菌也均存在多重耐藥性［5，12-21］，說(shuō)明廣西龜鱉源細(xì)菌對(duì)抗菌藥已經(jīng)產(chǎn)生了廣泛的耐藥性。經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，龜鱉養(yǎng)殖過(guò)程中濫用抗菌藥現(xiàn)象確實(shí)非常普遍，如將抗菌藥作為預(yù)防藥物長(zhǎng)期使用、龜鱉發(fā)生疾病時(shí)憑經(jīng)驗(yàn)使用多種抗菌藥物進(jìn)行治療、為了快速見(jiàn)效常加大用藥劑量或縮短用藥間隔等，這些盲目使用抗菌藥的效果多不理想，不但造成藥物浪費(fèi)，而且延誤病情，給養(yǎng)殖戶(hù)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失;還會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)及耐藥性不斷增強(qiáng)、產(chǎn)品藥物殘留超標(biāo)和環(huán)境污染等問(wèn)題，對(duì)龜鱉養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅，甚至威脅人類(lèi)公共衛(wèi)生安全。此外，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，多數(shù)龜鱉分離菌對(duì)一些禁用藥如紅霉素、氯霉素、氧氟沙星、諾氟沙星及人用藥特治星、特美汀和舒普深也存在部分或嚴(yán)重的耐藥性，提示在廣西龜鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中有可能使用過(guò)這些藥物，應(yīng)引起相關(guān)監(jiān)管部門(mén)的重視并采取措施介入監(jiān)管。因此，在龜鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)推行“防病不用抗菌藥，治病慎用抗菌藥”的原則，即在預(yù)防疾病時(shí)以使用中草藥、免疫增強(qiáng)劑、微生態(tài)制劑等增強(qiáng)龜鱉體質(zhì)和改善養(yǎng)殖環(huán)境為主，治病時(shí)應(yīng)及時(shí)送實(shí)驗(yàn)室診斷并根據(jù)藥敏試驗(yàn)盡早選取敏感藥物以適當(dāng)劑量給藥治療，做到科學(xué)、合理用藥，減少多重耐藥菌株的產(chǎn)生，避免給人和動(dòng)物帶來(lái)的危害。

本研究表明，廣西龜鱉疾病仍以細(xì)菌性疾病為主，且病原復(fù)雜、存在混合感染，其中以嗜水氣單胞菌、肺炎克雷伯菌和變形桿菌為主;48株分離自廣西發(fā)病龜鱉樣品的病原菌具有不同的敏感藥物譜和耐藥譜，均表現(xiàn)出多重耐藥性。

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