鄧谷霖，李萬平，殷 杰，李曉冰，張 紅，孫玉紅

目的觀察卡托普利對大鼠非酒精性脂肪肝的作用及其氧化應激的影響。方法將78只雄性SD大鼠隨機分為6組，正常組給予普通飼料；其余組(包括模型組)給予高脂飼料，造模6周后，將卡托普利高、中、低劑量組和羅格列酮組分別給予等體積高、中、低劑量卡托普利和羅格列酮；給予正常組和模型組等體積蒸餾水，6周后取血做血生化檢測及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)測定；取肝臟稱重，計算肝臟指數(shù)；取相同部位的肝組織勻漿測總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)；另取肝組織固定做病理檢查；其余液氮固定測定CYP2E1 mRNA。結果模型組谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、TC、TG、MDA、肝指數(shù)、CYP2E1 mRNA表達水平均增高，GSH含量下降；卡托普利高劑量組ALT、AST、TC、TG、MDA、肝指數(shù)、CYP2E1 mRNA表達水平均降低(P<0.05)，GSH含量升高(P<0.05)。肝臟病理學檢查顯示模型組可見肝細胞廣泛發(fā)生脂肪變性及炎癥反應，卡托普利高劑量組肝細胞脂肪變性與炎癥程度明顯減輕。結論卡托普利可增強抗氧化應激能力，減輕肝細胞脂肪變性，對非酒精性脂肪肝有一定的防治作用。

非酒精性脂肪肝；卡托普利；氧化應激；高脂飲食

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)疾病譜包括非酒精性肝臟脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化甚至是肝癌[1]，其發(fā)病率在發(fā)達國家成年人中已增加到30%，且仍在繼續(xù)上升[2]。NAFLD發(fā)生機制以氧化應激為主，還包括肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、線粒體脂肪酸氧化功能障礙等[3]。氧化應激是指人體在受到外界刺激時，高活性分子產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失去均衡，從而導致組織受損[4]。改變生活方式和避免攝入損肝藥物是NAFLD的主要治療方法，但療效并不明顯。而血管緊張素轉化酶抑制劑-卡托普利在機體抗氧化應激方面表現(xiàn)出良好的效果[5]，該文旨在觀察卡托普利對非酒精性脂肪肝的防治作用，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 健康雄性SD大鼠78只，SPF級，平均體重約130 g，由重慶騰鑫生物有限公司提供，合格證號：SCXK(渝)2012-0005。

1.1.2試劑與藥品 飼料級膽固醇(批號：20130407)、飼料級膽酸鈉(批號：20130327)購自安徽天啟化工科技公司；三酰甘油(total glycerol，TG)測定試劑盒(批號：2013060003)、總膽固醇(total cholesterol，TC)測定試劑盒(批號：2013030053)購自浙江東甌診斷產(chǎn)品公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒(批號：20130628)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒(批號：20130629)購自南京建成研究所；CYP2E1引物(批號：8402634571、8402634572)購自上海生工生物工程公司；羅格列酮片(批號：121007)購自成都恒瑞制藥公司；卡托普利片(批號：121103)購自汕頭金石制藥廠。

1.1.3主要儀器 Thermo超低溫冰箱(720型) 購自美國ThermoScientific公司；Gel DocTM EZ成像系統(tǒng)購自美國伯樂BIO-RAD公司；ST16R臺式高速冷凍離心機購自上海賽默飛世爾科技有限公司；722N型分光光度計購自紹興市杰聯(lián)儀器有限公司；SpectraMax M3多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司；制冰機(SIM-F124)購自日本三洋公司。

1.2方法

1.2.1分組、造模與給藥 將78只雄性SD大鼠隨機分為6組：正常組給予普通飼料喂食；其余組(包括模型組)給予高脂飼料(87.8%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇+0.2%膽酸鈉)喂食，造模6周確認大鼠脂肪肝模型建立后，將卡托普利高、中、低劑量組和羅格列酮組(統(tǒng)稱實驗組)分別給予高、中、低劑量卡托普利和羅格列酮溶于水后等體積喂食；給予正常組和模型組等體積蒸餾水，給藥6周?？ㄍ衅绽袆┝拷M和羅格列酮組按體表面積相對比值計算用藥量，卡托普利高劑量組、卡托普利低劑量組用藥量分別為卡托普利中劑量組的2倍和1/2。計算得出用藥量：卡托普利高劑量組為0.7 mg/100 g，相當于臨床劑量的10倍，卡托普利中劑量組0.35 mg/100 g，相當于臨床劑量的5倍，卡托普利低劑量組為0.175 mg/100 g，相當于臨床劑量的2.5倍，羅格列酮組為0.047 mg/100 g，相當于臨床劑量的5倍。

1.2.2樣本采集 給藥結束，大鼠禁食12 h后稱重，給予1%戊巴比妥鈉0.4 ml/100 g腹腔注射，腹主動脈取血，低溫離心，收集血清保存。然后將肝臟分離并取相同部位稱肝濕重，按組織重量(g) ∶乙醇體積(ml)=1 ∶9在冰水浴條件下進行勻漿并離心收集上清液，在-20 ℃保存；另取相同部位肝組織固定后用于病理學檢查。

1.2.3指標檢測方法 取大鼠血清，通過全自動生化分析儀測定其谷草轉氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，AST)、谷丙轉氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)、TC、TG。用TBA法檢測血清MDA；用比色法檢測血清GSH；用酶偶聯(lián)比色法檢測肝臟TG、TC，并計算肝指數(shù)(肝濕重/體重)。CYP2E1是細胞色素P450的一種代謝酶， CYP2E1 mRNA的測定：取少量肝組織磨碎勻漿，提取總RNA進行逆轉錄反應，分別加入CYP2E1和GAPDH基因引物進行PCR反應，然后在1.5%瓊脂糖凝膠中加入PCR產(chǎn)物及標志物進行電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)照相、觀察結果并記錄。肝組織用蘇木精-伊紅染色法染色用于病理學檢查。

2 結果

2.1血清生化指標與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、TC、TG含量均升高(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利高劑量組血清AST、ALT、TG、TC均降低(P<0.05)，羅格列酮組TG、TC水平降低(P<0.05)，見表1。

2.2大鼠肝濕重、肝指數(shù)和肝組織TG、TC含量與正常組相比，模型組與實驗組肝濕重和肝指數(shù)升高，模型組肝組織TG、TC升高(P<0.05)；與模型組相比，卡托普利高劑量組與羅格列酮組肝濕重與肝指數(shù)降低，卡托普利高劑量組與羅格列酮組肝組織TG及所有實驗組肝組織TC降低(P<0.05)。 見表2。

2.3血清MDA、GSH水平與正常組比較，模型組MDA含量升高、GSH含量降低(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利高劑量組與羅格列酮組血清MDA含量下降，卡托普利高劑量組血清GSH含量升高(P<0.05)。大鼠肝濕重、肝指數(shù)以及肝組織TG、TC水平。見表3。

表1 大鼠血清AST、ALT、TG、TC水平

與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

表2 大鼠肝濕重、肝指數(shù)以及肝組織TG、TC水平

與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖1 各組大鼠肝組織CYP2E1 mRNA和GAPDH表達

表3 大鼠血清MDA、GSH水平

與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4肝組織CYP2E1mRNA表達與正常組比較，模型組大鼠肝組織CYP2E1 mRNA表達升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，卡托普利高劑量組與羅格列酮組肝組織CYP2E1的表達下降(P<0.05)。見表4、圖1。

表4 大鼠肝組織CYP2E1 mRNA表達水平

與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.5肝組織病理變化正常組肝細胞無炎癥反應(圖2A)，模型組可見彌漫性脂肪變性，肝細胞水腫、細胞排列紊亂(圖2B)，卡托普利高劑量組可見少量脂肪變性，大多數(shù)肝細胞排列正常，部分細胞水腫(圖2C)，卡托普利中劑量組肝細胞脂肪變性與炎癥程度略有減輕(圖2D)，卡托普利低劑量組肝脂肪變性與炎癥程度與模型組相似，減輕不明顯(圖2E)，羅格列酮組病理變化情況與卡托普利高劑量組相似(圖2F)。

圖2 各組大鼠肝臟病理學變化 HE×200

A：正常組；B：模型組；C：卡托普利高劑量組；D：卡托普利低劑量組；E：卡托普利中劑量組；F：羅格列酮組

3 討論

與模型組相比，卡托普利高劑量組大鼠血清AST、ALT含量明顯降低，說明應用高劑量卡托普利后大鼠肝細胞損傷減輕，肝臟功能得到改善，血清與肝組織中TC、TG水平降低，說明肝細胞內(nèi)脂質(zhì)減少；實驗組大鼠肝濕重與肝指數(shù)均明顯減小，說明大鼠脂肪含量降低。病理學觀察顯示卡托普利高劑量組肝細胞變大明顯、細胞水腫的狀態(tài)有所減輕，淋巴細胞也明顯減少，炎癥情況有所好轉，脂質(zhì)沉積情況也有所減輕。通過生化檢測與病理觀察，表明卡托普利對大鼠NAFLD有一定的防治作用。MDA的含量可反映機體脂質(zhì)過氧化以及機體細胞過氧化損傷的程度，GSH的含量反映了對機體保持氧化及抗氧化平衡的能力。在本次研究中，通過高脂飼料喂食后，模型組大鼠MDA上升，GSH下降，說明其抗氧化能力減弱，通過給藥卡托普利后，卡托普利高劑量組大鼠MDA下降、GSH上升，表明其抗氧化能力得到增強，機體氧化應激程度減輕，從而NAFLD得到改善。

作為細胞色素P450的重要一員，CYP2E1在脂質(zhì)氧化反應中表現(xiàn)出很強的促氧化活性。有報道[6]表明，以CYP2E1為中心形成的氧自由基、脂質(zhì)過氧化，進而導致肝實質(zhì)損傷是NAFLD的重要發(fā)病機制。實驗中模型組CYP2E1 mRNA的表達跟正常組比顯著升高，而給藥高劑量卡托普利后，大鼠肝臟CYP2E1 mRNA的表達顯著降低，表明卡托普利可通過減少CYP2E1 mRNA表達，發(fā)揮抗氧化應激作用，改善體內(nèi)氧化應激與脂質(zhì)過氧化狀態(tài)，從而改善NAFLD。

綜上所述，卡托普利對非酒精性脂肪肝能發(fā)揮一定防治作用，同時能增強模型組大鼠抗氧化應激從而改善病情。

[1] 李楓林,張 寶,管石俠.非酒精性脂肪肝病大鼠IL-1β, IL-18, TNF-α水平的變化[J].安徽醫(yī)科大學學報,2016,51(3):351-4.

[2] Dietrich P,Hellerbrand C.Non-alcoholic fatty liver disease,obesity and the metabolic syndrome[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol,2014,28 (4):637-53.

[3] Tariq Z,Green C J,Hodson L.Are oxidative stress mechanisms the common denominator in the progression from hepatic steatosistowards non-alcoholic steatohepatitis (NASH)[J].Liver Int,2014,34(7):e180-90.

[4] 張 偉,洪汝濤.NF-κB、氧化應激在酒精性脂肪肝發(fā)病機制中的作用及水飛薊素干預研究[D].合肥：安徽醫(yī)科大學, 2012:1-57.

[5] Tota S, Kamat P K, Saxena G, et al. Central angiotensin converting enzyme facilitates memory impairment in intracerebroventricular streptozotocin treated rats[J]. Behav Brain Res, 2012,226(1):317-30.

[6] 王悅之,張 玉.CYP2E1與非酒精性脂肪肝[J].胃腸病學和肝病學雜志,2012,21(4):384-6.