王 翰，倪新強，曹永凱，杜端明，唐愛發(fā)

目的研究骨髓基質抗原2(STAG2)基因在人腎癌組織和腎癌細胞中的表達水平并研究STAG2基因對腎癌細胞生物學表型的影響。方法使用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測STAG2基因在5株腎癌細胞、1株正常腎細胞和68對腎癌及其對應的癌旁組織中的表達水平；使用Western blot法分析STAG2蛋白在5株腎癌細胞、1株正常腎細胞的表達特點；使用慢病毒包裝感染ACHN、786-O細胞并使用qRT-PCR檢測感染效率；CCK8試劑盒檢測STAG2過表達后對腎癌細胞增殖的影響；Transwell法檢測STAG2過表達后對腎癌細胞侵襲的影響；流式細胞術檢測STAG2過表達后對腎癌細胞凋亡的影響。結果① qRT-PCR結果顯示，與正常腎細胞相比，STAG2基因在5株腎癌細胞的表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；② Western blot結果顯示在5株腎癌細胞中STAG2蛋白表達明顯低于正常腎細胞；③ qRT-PCR檢測腎癌及其癌旁組織的STAG2表達水平結果顯示與其對應癌旁組織相比，72.06%(49/68)腎癌組織中STAG2表達水平下降(P<0.01)；腎癌組織中STAG2表達水平與腫瘤的臨床病理分期相關(P=0.029)，與患者年齡、性別、腫瘤組織學分級無明顯相關性；④ 慢病毒感染ACHN、786-O細胞后STAG2表達水平明顯升高(P<0.01)；⑤ 體外實驗中，過表達STAG2基因明顯抑制腎癌細胞的增殖和遷移能力，促進腎癌細胞的早期凋亡(P<0.05，P<0.01)。結論① 在腎癌細胞和腎癌組織中STAG2的表達水平均有明顯的下降，提示STAG2可能參與腎癌的發(fā)生和發(fā)展的過程，STAG2低表達對腎癌的早期診斷可能提供一些幫助；② 上調STAG2基因的表達明顯抑制腎癌細胞的增殖和遷移能力、促進腎癌細胞的凋亡，提示STAG2可能成為治療腎癌的一個潛在靶點。

STAG2；腎腫瘤；細胞增殖；細胞遷移

腎細胞癌約占腎臟腫瘤的80%～90%，由多種腎實體瘤構成的，其中約75%為腎透明細胞癌，10%為乳頭狀癌，5%為嫌色細胞癌，是常見的惡性腫瘤之一，每年約有200 000例新增患者，發(fā)病率在男性惡性腫瘤中排第5位，女性中排第7位，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。20%的患者會進展為局部晚期，30%的患者會發(fā)生遠處轉移，尋找更有效的免疫治療靶點開發(fā)新的靶向藥物是當前迫切需要解決的問題，而骨髓基質抗原2(stromal antigen 2，STAG2)基因在多種腫瘤中研究被證實與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關[2]。STAG2基因位于X染色體上，含有39個外顯子以及4種編碼mRNA，翻譯的SA2蛋白分子量大小為141 ku，是黏合復合蛋白的4個核心亞基之一(SMC1A、SMC3、 RAD21、STAG1/2)，黏合復合蛋白在減數分裂期間參與染色單體的分離和聯會，同時也參與有絲分裂及減數分裂期間的DNA修復、基因表達調節(jié)、基因組印記以及上皮細胞向間質細胞的轉變過程。該實驗主要研究STAG2基因在腎癌組織及腎癌細胞中的表達并研究STAG2對腎癌細胞生物學表型的影響，為臨床上腎癌的診斷和治療提供新的診斷依據和治療靶點。

1 材料與方法

1.1材料根據隨機化原則，選取2013年10月～2014年10月于珠江醫(yī)院保存的腎癌組織及其癌旁正常組織樣本68例。所需樣本得到醫(yī)院的倫理委員會的批準并獲得患者知情同意。本實驗所用的人種屬的正常人胚腎細胞293-FT以及腎癌細胞CAKI-1、CAKI-2、786-O、769-P、ACHN均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫；DMEM、1640培養(yǎng)基、McCoy′s5A、PBS、澳洲胎牛血清培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/ PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國賽默飛世爾公司；細胞毒性檢測試劑盒(CCK-8)購自美國Sigma Aldrich公司；反轉錄試劑盒購自德國QIAGEN公司；TRIzol購自美國Invitrogen Burlington公司；Anti-SA2 antibody、Anti-Tubulin antibody購自美國Abcam公司；慢病毒包裝購自上海吉凱基因公司。

1.2方法

1.2.1RNA提取、cDNA合成、實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)實驗 按照TRIzol reagent使用說明提取細胞RNA以及組織RNA，使用反轉錄試劑盒去除基因組DNA后合成20 μl單鏈cDNA。反應混合物在37 ℃孵育5 min，95 ℃、30 min，之后置于冰上。qRT-PCR實驗試劑選用SYBR Premix Taq Ⅱ，β-actin作為內參，引物序列見表1，每20 μl的反應體系中含有0.5 μm的前引物和0.5 μm后引物，10 μl的SYBR Premix，7 μl無酶水，2 μl的cDNA。具體反應步驟如下：第一階段：反應預變性，95 ℃、30 s；第二階段PCR反應，95 ℃、5 s，60 ℃、1 min；第三階段，溶解曲線分析，95 ℃、15 s(溫度上升速率1.6 ℃/s)，60 ℃、1 min(溫度上升速率1.6 ℃/s)，95 ℃、15 s(溫度上升速率0.05 ℃/s)。

表1 引物序列

1.2.2Western blot實驗 配制分離膠，灌入2/3的分離膠后立即封膠，30 min后倒掉上層液體，灌入濃縮膠，插上梳子；將樣品蛋白調至等濃度，充分混合沉淀加上樣緩沖液后上樣，以初始電壓90 V電泳約30 min后改成120 V約110 min，在目的蛋白泳動至膠下緣1 cm左右結束電泳結束前15 min左右準備轉膜緩沖液剪與膠大小差不多一致的PVDF膜，分別在無水乙醇、水、轉膜緩沖液浸沒15、2、5 min將膜取出，轉膜90 mA 100 min；將膜取出浸泡于5%的封閉液中1 h，浸泡完過后用TBST清洗膜3次，每次6 min。根據抗體說明書將抗體用2%的封閉液稀釋，將膜浸泡于抗體液中4 ℃孵育過夜。次日取出膜，TBST清洗膜3次，每次6 min，而后加入二抗繼續(xù)室溫孵育1 h。接著TBST清洗膜3次，每次6 min。曝光，查看條帶。

1.2.3慢病毒轉染及效果驗證 STAG2過表達慢病毒包裝購自上海吉凱基因公司。選取對數生長期的細胞消化、離心、去上清液加培養(yǎng)基，接種至6孔板內，每孔50 000個細胞，次日加入已經確定的最佳感染細胞的感染復數值病毒，1 μl聚凝胺/ml，8 h后觀察細胞形態(tài)，無明顯變化則更換正常培養(yǎng)基，72 h后熒光顯微鏡下觀察細胞表達豐度，更換含有適量濃度嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)轉細胞株直到鏡下熒光豐度接近100%。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖能力 取對數生長期的感染后慢病毒后的腎癌細胞、消化、離心，接種至96孔板中，每孔100 μl，含有4×103～6×103個細胞，標注實驗組與對照組(含有目的基因為實驗組，空載病毒為對照組)，設置0、24、48、72 h 4個時間組別，每組5個復孔。24 h后，0 h組每孔加入10 μl的CCK-8溶液，避光放入5%的CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育1 h，在酶標儀上檢測加入CCK-8組的細胞在450 nm處的吸光值，記錄實驗結果。24、48、72 h操作步驟如上，統(tǒng)計實驗數值繪制生長曲線。

1.2.5Transwell法檢測細胞侵襲能力 使用純的培養(yǎng)基按照8 ∶1的比例稀釋基質膠，再把稀釋后的基質膠鋪在Transwell小室上(Coring，膜孔徑8 μm)，每個小室鋪60 μl基質膠，放置于5%的CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱過夜。取感染慢病毒后的腎癌細胞，棄掉細胞中舊的培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，換成純培養(yǎng)基(不含血清)，放置于5%的CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱過夜。取前1 d換成純培養(yǎng)基的細胞，消化、離心、制備細胞懸液、平板計數器計數，每個小室接種60 000個轉染后的細胞，上室液體體積定容到200 μl，同時下室加入600 μl的含有30%胎牛血清的培養(yǎng)基，放置于5%的CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱孵育36 h。吸掉小室內的培養(yǎng)基，PBS清洗小室內部2次，注意不要清洗小室外側底部，加入甲醇500 μl固定30 min，之后風干3 min，再取0.1%的結晶紫，染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未穿過基底膜的細胞，顯微鏡下觀察計數，隨機選取5個視野計數。將小室放回24孔板中，空板內加入1 ml/孔的冰醋酸，放置搖床慢搖20 min，將孔板內的醋酸等分10份打入96孔板，酶標儀選擇570 nm測量光密度(optical density，OD)值。

1.2.6細胞凋亡實驗 使用去離子水將10×結合緩沖液稀釋成1×結合緩沖液。取感染后慢病毒后的腎癌細胞，PBS清洗2遍，0.25%胰酶(不含乙二胺四乙酸)消化后吸取加到15 ml離心管內，如果沒有不含乙二胺四乙酸的胰酶則需要在標記前用PBS或者1×結合緩沖液徹底清洗干凈，避免感染Annexin V離心管放置于離心機內，配平離心機調節(jié)轉速1 000 r/min離心3 min。加入1×結合緩沖液重懸細胞，使細胞密度在0.2×106～1×106個/ml。取200 μl的離心管，然后取上述配置好的混合液100 μl、5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI Staining Solution充分混合均勻，避光15 min。反應結束后加400 μl 結合緩沖液輕輕混勻再1 h內上流式細胞儀檢測。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析。使用配對樣本t檢驗分析STAG2基因在腎癌及其配對癌旁組織中的表達差異；χ2檢驗用于分析STAG2表達與臨床病理特征之間的關系；單因素方差分析以及獨立樣本t檢驗用于其他數據分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1STAG2基因在腎癌組織中低表達通過qRT-PCR檢測68對腎癌組織及其配對的癌旁組織中的STAG2基因的mRNA表達水平，結果如圖1A所示，STAG2基因在腎癌組織的表達水平明顯低于癌旁組織的表達水平(P<0.01)。而且從圖1B中可以看出，癌旁組織中的STAG2表達水平平均明顯高于腎癌組織的表達水平，約2.17倍(P<0.01)。

圖1 STAG2基因在腎癌及其癌旁組織表達水平

A：STAG2在68對腎癌及癌旁組織中的表達；B：STAG2在腎癌組織中表達水平；與癌旁組織比較：**P<0.01

2.2STAG2基因表達降低與腎癌患者臨床病理特征之間的關系通過qRT-PCR檢測68對腎癌組織及其配對的癌旁組織中的STAG2基因的mRNA表達水平，顯示有72.06%(49/68)的腎癌組織中STAG2相比較于癌旁組織低表達，而27.94%(19/68)的腎癌組織中STAG2相比較于癌旁組織高表達(P<0.01)。而STAG2表達水平與患者臨床病理特征之間的關系如表2所示：結果顯示STAG2在腎癌組織中的表達水平患者的臨床病理分期顯著相關(P=0.029)，STAG2表達水平與TNM分期呈負相關性(P<0.05)；而與患者年齡、性別、組織分級無明顯相關性；這些結果提示STAG2在腎癌中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，抑制腫瘤的生長。

表2 STAG2表達與患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3STAG2基因在腎癌細胞系中的表達采用qRT-PCR檢測STAG2基因在人正常胚腎細胞293-FT以及ACHN、CAKI-1、CAKI-2、786-O、769-P等6株細胞中的mRNA表達水平，相比較于人正常胚腎細胞293-FT細胞而言，STAG2基因在ACHN、CAKI-1、CAKI-2、786-O、769-P 5株腎癌細胞中的表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Western blot檢測STAG2基因在6株細胞中的蛋白表達水平，相比較于人正常胚腎細胞293-FT細胞而言，STAG2基因在5株腎癌細胞中的蛋白表達水平明顯降低。見圖2。

2.4過表達STAG2基因的效率檢測qRT-PCR檢測感染STAG2慢病毒過表達載體后的ACHN、786-O兩株腎癌細胞系STAG2表達水平。將STAG2慢病毒過表達載體和陰性對照病毒載體分別感染ACHN和786-O細胞，結果如圖3所示，相對于陰性對照而言，感染STAG2慢病毒過表達載體的細胞STAG2表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 STAG2基因在腎癌細胞中的表達水平

1：293-FT；2：ACHN；3：769-P；4：786-O；5：CAKI-2；6：CAKI-1;與293-FT比較：**P<0.01

圖3 腎癌細胞感染慢病毒后的STAG2表達水平

2.5過表達STAG2基因對腎癌細胞增殖的影響CCK-8法檢測感染STAG2慢病毒過表達載體后的ANCH、786-O兩株腎癌細胞系的增殖能力的變化，每隔24 h檢測一次OD值，統(tǒng)計分析5 d的結果，結果如圖4 所示，在786-O和ACHN兩個細胞系中，均顯示相對于陰性對照，過表達STAG2細胞的增殖能力明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。

2.6過表達STAG2基因對腎癌細胞侵襲的影響Transwell法檢測感染STAG2慢病毒過表達載體后的ANCH、786-O兩株腎癌細胞系侵襲能力的變化。相較于陰性對照，ACHN、786-O細胞系中STAG2基因過表達細胞穿過小室基底膜的細胞數明顯減少(圖5A、C)；同時經過檢測洗脫下來的細胞的結晶紫OD值如圖6B、D所示，STAG2基因過表達的OD值明顯低于陰性對照，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖4 STAG2基因過表達后的腎癌細胞增殖能力的變化

A：786-O細胞系；B：ACHN細胞系;與STAG2比較：*P<0.05，**P<0.01

2.7過表達STAG2基因對腎癌細胞凋亡的影響采用Annexin V-FITC/ PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測感染STAG2慢病毒過表達載體后的ACHN、786-O兩株腎癌細胞系凋亡能力的變化。圖6A、B顯示在786-O中，感染STAG2慢病毒過表達載體后早期凋亡細胞數明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；圖6C、D顯示在ACHN中，感染STAG2慢病毒過表達載體后早期凋亡細胞數明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖5 STAG2基因過表達后的腎癌細胞侵襲能力的變化 結晶紫染色×20

A、B：過表達STAG2基因抑制786-O細胞侵襲能力；C、D：過表達STAG2抑制ACHN細胞侵襲能力;與陰性對照比較：**P<0.01

3 討論

腎癌在所有成人腫瘤發(fā)病中占約2%～3%，在男性中排第7位，女性中排第9位的惡性腫瘤，每年約有20 900例新發(fā)病例，102 000例死亡[3]。腎癌不是單一性疾病，主要由多重不同組織學類型的腫瘤構成，不同的臨床類型由不同的基因引起，了解腎癌的遺傳基礎可以給治療腎癌提供新的治療契機。目前針對腎透明細胞癌的治療通過靶向治療有了長足的進展，最新研究[4]顯示，染色質重塑以及組蛋白修飾基因如PBRM1和SETD2等可能在腎細胞癌遺傳學基礎上有著重要作用，新的免疫治療藥物如CTLA4抑制劑、伊匹單抗等開辟了新的臨床試驗方向，一些新的針對血管內皮生長因子受體信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路以及缺氧誘導因子2靶向藥物的開發(fā)為腎細胞癌的免疫治療提供了有效的幫助。Linehan et al[5]對腎癌的遺傳學基礎提出了概括，指出目前已知至少有12個基因導致腎癌：FLCN，延胡索酸水合酶、琥珀酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、TFE3、TFEB、MITF、TSC1、TSC2和PTEN，然而這些基因參與細胞的有氧呼吸、鐵、營養(yǎng)物質的運輸等重要環(huán)節(jié)，提示腎腫瘤本質上可能是一種代謝性疾病。STAG2基因是黏合復合蛋白的4個核心亞基之一，與RAD21、SMC1、SMC3共同構成黏合復合蛋白參與細胞有絲分裂以及減數分裂的染色體分離、聯會以及姐妹染色單體的形成[6-7]；Solomon et al[2]研究發(fā)現STAG2靶向失活突變可導致人染色體非整倍體；Balbás-Martínez et al[8]研究結果顯示在膀胱癌中STAG2頻繁失活突變并不會產生染色體非整倍體；可能與不同的腫瘤細胞染色體穩(wěn)定性差異有關。Kim et al[9]發(fā)現在胃癌、結直腸癌、前列腺癌中均有STAG2表達缺失但是無突變；而在髓樣腫瘤中STAG2頻繁發(fā)生突變和表達缺失[10]；在結直腸癌、胃癌以及前列腺癌中均發(fā)現有STAG2基因表達缺失[11-12]，目前尚未有關STAG2基因與腎癌之間的關系的報道。

本研究主要闡明了STAG2基因表達水平與腎癌的相關關系，初步揭示了STAG2在腎癌中的生物學功能。本研究顯示STAG2基因在腎癌組織中表達水平降低，且與患者的臨床病理分期有關，而與患者的年齡、性別、組織學分級并無明顯相關性。本研究在此基礎上又驗證了STAG2基因在腎癌細胞中mRNA表達水平，結果顯示與正常的腎組織相比，STAG2在腎癌細胞的表達水平明顯下降，Western blot結果顯示STAG2基因蛋白表達水平與mRNA表達基本一致，結合STAG2基因在其他腫瘤的表達研究，初步表明STAG2基因在腎癌的發(fā)生發(fā)展中扮演者抑癌基因的角色。為了驗證此假設，接著，進一步驗證STAG2基因在腎癌中的相關生物學功能，本研究構建慢病毒過表達載體過表達STAG2基因感染腎癌細胞，分別使用CCK-8法、Transwell以及流式細胞術檢測在腎癌中過表達STAG2基因對腎癌細胞的生物學功能產生的影響，實驗結果顯示過表達STAG2基因后，腎癌細胞的增殖、侵襲能力明顯下降，腎癌早期凋亡明顯增多。通過上述生物學功能實驗結果表明STAG2基因在腎癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用，在臨床上可能由于STAG2基因的表達缺失而導致腎癌不斷進展，如腫瘤體積增大，局部浸潤以及發(fā)生遠處轉移。本研究初步揭示了STAG2在腎癌中的生物學功能，但是其在腎癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機制尚不清楚，有待進一步研究。后續(xù)研究可從以下幾個方面著手：由本研究結果提示STAG2在腎癌的增殖和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用，后續(xù)可以研究STAG2基因信號通路，找出其下游或上游的作用靶基因，利用免疫共沉淀等技術找出相關作用蛋白，找出其共同作用的基因后可以分析幾個基因之間的作用關系和特點，在裸鼠上進一步進行驗證試驗結果，找出有效的作用基因或蛋白。

圖6 STAG2基因過表達后細胞凋亡能力的變化

A、B：過表達STAG2促進786-O細胞早期凋亡；C、D：過表達STAG2促進ACHN細胞早期凋亡;與陰性對照比較：**P<0.01

綜上所述，本實驗數據提示STAG2基因在腎癌中可能起著抑癌基因的作用抑制腫瘤細胞的生長，STAG2低表達對腎癌的早期診斷可能提供一些幫助，可能成為治療腎癌的一個潛在靶點。

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