許 冰，李 娟，柴小青，楊 佳

目的評(píng)價(jià)七氟醚與芬太尼對(duì)老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響。方法隨機(jī)將120只Wistar老齡大鼠分為4組：假手術(shù)組、心肌缺血再灌注模型組、七氟醚組、芬太尼組。術(shù)后4周和8周采集大鼠腦組織標(biāo)本和血標(biāo)本，流式細(xì)胞術(shù)用于測(cè)定大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡率以及胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子水平，TUNEL用于測(cè)定大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡指數(shù)。ELISA試驗(yàn)用于測(cè)定大鼠心尖血液中炎癥因子含量，熒光探針用于測(cè)定大鼠海馬神經(jīng)元胞質(zhì)中線粒體的膜電位情況。采用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠術(shù)后認(rèn)知功能。結(jié)果與心肌缺血再灌注模型組相比，七氟醚組和芬太尼組學(xué)習(xí)潛伏期和記憶潛伏期縮短，腫瘤壞死因子(TNF)-α和白介素(IL)-1β表達(dá)降低而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)升高，大鼠神經(jīng)元凋亡率和凋亡指數(shù)降低，鈣離子向神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移減少，神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)線粒體膜電位活性有所升高(P<0.05)。七氟醚組與芬太尼組相比，其學(xué)習(xí)潛伏期和記憶潛伏期縮短，TNF-α和IL-1β表達(dá)降低而VEGF表達(dá)升高，大鼠神經(jīng)元凋亡率和凋亡指數(shù)降低，神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)線粒體膜電位活性有所升高(P<0.05)。結(jié)論七氟醚和芬太尼可提高老齡大鼠術(shù)后VEGF表達(dá)水平，減低IL-1β和TNF-α等炎癥因子的釋放，七氟醚和芬太尼還能夠減少缺血再灌注后大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，減輕了老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。其中，七氟醚效果更佳。

炎癥反應(yīng)；麻醉劑；老齡大鼠；認(rèn)知功能

作為一種老年患者常見的嚴(yán)重術(shù)后并發(fā)癥，術(shù)后認(rèn)知功能障礙主要表現(xiàn)為持續(xù)性的認(rèn)知功能下降，周期可達(dá)數(shù)月到一年[1]。既往研究[2]證實(shí)，臨床常用麻醉藥七氟醚和芬太尼能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的上調(diào)，并抑制白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)，這些作用對(duì)老齡大鼠急性心肌缺血再灌注后認(rèn)知功能損害的康復(fù)具有積極的意義。該研究通過觀察七氟醚和芬太尼兩種麻醉藥物對(duì)老齡大鼠認(rèn)知功能的影響，探討相關(guān)機(jī)制，為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供120只鼠齡為19～21個(gè)月體重為300～350 g的雌性Wistar大鼠。大鼠研究前12 h禁食，自由飲水。本次實(shí)驗(yàn)計(jì)劃已被安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2急性心肌缺血再灌注大鼠動(dòng)物模型的建立大鼠用3 %戊巴比妥麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，監(jiān)測(cè)大鼠的生命體征和心電圖。經(jīng)口插入呼吸管，連接呼吸機(jī)，并行股動(dòng)脈穿刺置管。沿左側(cè)鎖骨中線于第四、五肋間進(jìn)入胸腔暴露大鼠心臟，然后結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈，放松結(jié)扎線后抬高的ST-T段降低1/2以上，證實(shí)大鼠心肌缺血的發(fā)生。通常結(jié)扎30 min后即可發(fā)生心肌缺血，缺血再灌注通過再灌注后心律失?；蛐募☆伾淖儊泶_定。再灌注120 min后，將大鼠縫合，并放回盒中。大鼠蘇醒后單獨(dú)飼養(yǎng)，術(shù)后前3天予以肌肉注射丁丙諾啡(0.5 mg/kg)和頭孢呋辛(100 mg/kg)。小動(dòng)物呼吸機(jī)購自美國哈佛儀器公司(哈佛型638)。

1.3分組按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組：大鼠在左冠狀動(dòng)脈穿線而不結(jié)扎，心肌缺血再灌注模型組：大鼠被設(shè)置為心肌缺血再灌注模型組，七氟醚組：在心肌缺血再灌注模型組的基礎(chǔ)上，大鼠吸入2%七氟醚，每天持續(xù)2 h，連續(xù)5 d，同時(shí)監(jiān)測(cè)七氟醚濃度，芬太尼組：在心肌缺血再灌注模型組的基礎(chǔ)上，大鼠靜脈注射50 μg/kg芬太尼，2 μg/(kg·min)靜脈滴注維持1 h，連續(xù)5 d。

1.4行為學(xué)檢測(cè)治療后的第4周和第8周應(yīng)用水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠的認(rèn)知功能。實(shí)驗(yàn)分為學(xué)習(xí)階段和記憶階段。實(shí)驗(yàn)開始前提前將大鼠置于水迷宮所在的房間，讓其充分適應(yīng)環(huán)境。學(xué)習(xí)階段設(shè)計(jì)為1周時(shí)間，操作人員每次將大鼠面向池壁從不同的入水點(diǎn)緩緩放入水迷宮，學(xué)習(xí)潛伏期為大鼠放入水中開始尋找并爬上水中平臺(tái)的時(shí)間。經(jīng)不同方式處理后大鼠尋找水中平臺(tái)的時(shí)間，即為記憶潛伏期。

1.5大鼠腦組織標(biāo)本和血標(biāo)本取材及指標(biāo)檢測(cè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取大鼠10只，經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥(50 mg/kg)進(jìn)行麻醉后，對(duì)大鼠行心尖部穿刺，每只大鼠取3 ml血，并置于抗凝抽血管內(nèi)留待檢測(cè)；采血完成后將大鼠斷頭處死，并立刻于冰上操作提取大鼠腦組織。

1.5.1采用ELISA測(cè)定血液中炎癥因子的含量

1.5.2采用TUNEL檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡指數(shù) 在40倍視野下隨機(jī)選取海馬組織切片5個(gè)不同的區(qū)域，計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域凋亡神經(jīng)元及神經(jīng)元總數(shù)，計(jì)算凋亡神經(jīng)元占神經(jīng)元總數(shù)百分比，取5個(gè)不同區(qū)域的平均值做為凋亡指數(shù)。

1.5.3采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定海馬神經(jīng)元的凋亡率及鈣離子水平 將100 g大鼠海馬組織制備成濃度為1×106/ml的單細(xì)胞混懸液，加入特異性熒光標(biāo)志物混勻,避光孵育5 min，利用Epics2XLⅡ型流式細(xì)胞儀檢測(cè)混懸液熒光強(qiáng)度，檢測(cè)海馬神經(jīng)元的凋亡率;并通過鈣離子熒光探針檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)鈣離子水平。

1.5.4JC-1熒光染色測(cè)定海馬神經(jīng)元胞質(zhì)中線粒體的膜電位水平 利用熒光探針對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)線粒體進(jìn)行JC-1熒光染色，流式細(xì)胞儀測(cè)定呈現(xiàn)紅色熒光線粒體與綠色熒光線粒體的熒光強(qiáng)度，通過對(duì)比反映線粒體的膜電位情況。

2 結(jié)果

2.1各組水迷宮實(shí)驗(yàn)比較在第4周和第8周，與假手術(shù)組相比，其他三組大鼠學(xué)習(xí)潛伏期和記憶潛伏期延長(zhǎng)(P<0.001)。與心肌缺血再灌注模型組相比，七氟醚組和芬太尼組大鼠學(xué)習(xí)潛伏期和記憶潛伏期縮短(P<0.001)。見表1。

2.2各組血漿中炎癥因子的水平比較術(shù)后第4周和第8周的血漿中的VEGF含量各組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中假手術(shù)組表達(dá)水平最低，顯著低于心肌缺血再灌注模型組、七氟醚組和芬太尼組，相對(duì)于芬太尼組，七氟醚組表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組在術(shù)后4周和第8周的血漿中的IL-1β含量各組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中心肌缺血再灌注模型組表達(dá)水平最高，顯著超過其他三組，芬太尼組較七氟醚組表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組TNF-α含量的變化趨勢(shì)同IL-1β。見表2。

2.3各組海馬神經(jīng)元凋亡情況比較心肌缺血再灌注模型組手術(shù)后24 h、4、8 周，大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡指數(shù)和凋亡率均明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各時(shí)間段七氟醚組均略高于假手術(shù)組，提示大鼠海馬神經(jīng)元由于缺血性損傷導(dǎo)致凋亡增多，但七氟醚的使用使得凋亡較心肌缺血再灌注模型組有所降低；第8周七氟醚組海馬神經(jīng)元凋亡率和凋亡指數(shù)接近假手術(shù)組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；七氟醚組與芬太尼組相比，各時(shí)間段神經(jīng)元凋亡率與凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3、4。

2.4各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量比較心肌缺血再灌注模型組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量手術(shù)后24 h、4周、8周均明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，各時(shí)間段七氟醚組海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量均略高，提示缺血性損傷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，但是七氟醚的使用使得細(xì)胞內(nèi)鈣超載與心肌缺血再灌注模型組比較有所降低；海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量在第8周時(shí)與假手術(shù)組十分接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；芬太尼組與七氟醚組相比，各時(shí)段神經(jīng)元鈣離子含量?jī)山M間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

表1 4組大鼠學(xué)習(xí)潛伏期和記憶潛伏期的比較

與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與芬太尼組比較：#P<0.05；與心肌缺血再灌注模型組比較：△P<0.05

2.5各組線粒體膜電位的比較與假手術(shù)組相比，缺血再灌注模型組大鼠手術(shù)后24 h、4周、8周較多細(xì)胞發(fā)生明顯的線粒體膜電位下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但是治療后4周和8周兩組比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示缺血再灌注模型組線粒體膜電位活性在手術(shù)后持續(xù)明顯下降。七氟醚組治療后線粒體膜電位活性逐漸恢復(fù)，至第8周時(shí)與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。芬太尼組治療后線粒體膜電位活性逐漸恢復(fù)，與心肌缺血再灌注模型組在各時(shí)段比較線粒體膜電位活性均減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第8周時(shí)線粒體膜電位活性低于假手術(shù)組活性，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表2 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中炎癥因子的比較

與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與芬太尼組比較：#P<0.05；與心肌缺血再灌注模型組比較：△P<0.05

表3 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元凋亡率的比較

與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與芬太尼組比較：#P<0.05；與心肌缺血再灌注模型組比較：△P<0.05

表4 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)的比較

與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與芬太尼組比較：#P<0.05；與心肌缺血再灌注模型組比較：△P<0.05

表5 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的比較

與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與芬太尼組比較：#P<0.05；與心肌缺血再灌注模型組比較：△P<0.05

表6 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)線粒體膜電位的比較

與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與芬太尼組比較：#P<0.05；與心肌缺血再灌注模型組比較：△P<0.05

3 討論

水迷宮實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)估大鼠的神經(jīng)認(rèn)知治療效果，是最常用的研究行為神經(jīng)科學(xué)的工具之一。本研究結(jié)果表明，老齡大鼠術(shù)后學(xué)習(xí)潛伏期和記憶潛伏期延長(zhǎng)，表明老齡大鼠心肌缺血再灌注后發(fā)生了認(rèn)知功能障礙。

隨著人口老齡化的加劇，老年患者手術(shù)量日益增加。老年患者手術(shù)后認(rèn)知功能的改變引起醫(yī)務(wù)工作者的重視。七氟醚是鹵族吸入麻醉藥，其優(yōu)點(diǎn)眾多，因此廣泛應(yīng)用于臨床麻醉。七氟醚對(duì)老年患者的認(rèn)知功能是否產(chǎn)生的影響需要進(jìn)行深入的探討研究。重大的手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)致多種炎癥因子的釋放。研究[3]表明動(dòng)物發(fā)生認(rèn)知功能障礙的原因可能為促炎遞質(zhì)釋放從而促進(jìn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性遞質(zhì)可通過直接或間接的途徑從而影響中樞神經(jīng)功能，TNF-α和IL-1可透過血腦屏障引起中樞神經(jīng)炎性反應(yīng)[4-5]。TNF-α是有單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生的一種炎癥因子，大鼠的認(rèn)知功能的降低與TNF-α水平的增高相關(guān)。VEGF作為一種生長(zhǎng)因子，具有促血管、神經(jīng)生成、以及神經(jīng)保護(hù)等作用，在缺血低氧狀態(tài)下，VEGF的表達(dá)會(huì)增多[6-7]。VEGF除了在腦血管疾病中發(fā)揮重要作用，在與大腦的認(rèn)知功能方面也扮演著積極的角色。本研究結(jié)果表明，術(shù)后第4周和第8周，七氟醚組和芬太尼組VEGF表達(dá)水平較心肌缺血再灌注模型組升高而IL-1β和TNF-α含量降低。提示七氟醚和芬太尼的使用可以降低炎癥因子的表達(dá)，提高VEGF的表達(dá)，從而改善老齡大鼠的術(shù)后認(rèn)知功能。

認(rèn)識(shí)功能是大腦的重要基本功能之一，而海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與認(rèn)知功能關(guān)系密切的腦區(qū)，海馬發(fā)生病理或生理改變可導(dǎo)致大腦的認(rèn)知功能受損。急性腦血管病時(shí)，機(jī)體可產(chǎn)生大量的氧自由基，并從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生鈣超載，通常認(rèn)為線粒體腫脹可由神經(jīng)元中鈣離子超載進(jìn)入線粒體內(nèi)，導(dǎo)致神經(jīng)毒性的發(fā)生甚至海馬神經(jīng)元壞死和凋亡[8]。七氟醚預(yù)處理后，大鼠海馬神經(jīng)元胞質(zhì)中線粒體內(nèi)的鉀離子通道被激活，從而進(jìn)一步促進(jìn)鉀離子進(jìn)入線粒體內(nèi)，提高了線粒體膜電位活性，從而拮抗大鼠海馬神經(jīng)元因缺血性再灌注損傷所致的壞死和凋亡[9]。本研究中，通過激活海馬神經(jīng)元胞質(zhì)mitoKATP通道，七氟醚預(yù)處理從而減少了胞質(zhì)Ca2+超載以及Ca2+流入線粒體，最終減少了線粒體腫脹及細(xì)胞凋亡的發(fā)生，達(dá)到改善老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的目的。線粒體屬于自由基氧化應(yīng)激損傷的重要亞細(xì)胞靶標(biāo)。急性腦血管病時(shí)神經(jīng)元的損傷其病理生理過程十分復(fù)雜，神經(jīng)元死亡的核心環(huán)節(jié)包括氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元線粒體氧化應(yīng)激及電生理功能障礙[10]。研究[11]顯示隨著缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，線粒體脂質(zhì)過氧化后形成的氧化應(yīng)激產(chǎn)物丙二醛含量逐漸上升。通過測(cè)定腦卒中發(fā)生后線粒體膜電位情況，結(jié)果顯示線粒體膜電位出現(xiàn)了持續(xù)性的下降。在急性腦血管病發(fā)生后，氧自由基產(chǎn)生的速度明顯增加, 而氧化應(yīng)激水平過高，又進(jìn)一步引起線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的持續(xù)開放[10，12]。經(jīng)過分析海馬神經(jīng)元細(xì)胞的紅綠色熒光相對(duì)比例，流式細(xì)胞儀可以通過散點(diǎn)圖計(jì)算線粒體膜電位下降細(xì)胞的比例。與假手術(shù)組相比，血管性認(rèn)知障礙模型組線粒體膜電位活性在手術(shù)后持續(xù)明顯下降。經(jīng)七氟醚治療后七氟醚組的線粒體膜電位活性逐漸恢復(fù)，經(jīng)芬太尼治療后芬太尼組線粒體膜電位活性也逐漸恢復(fù)，但至第8周時(shí)仍低于假手術(shù)組活性。

綜上所述，七氟醚和芬太尼可以有效減輕老齡大鼠因心肌缺血再灌注導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制與提高VEGF表達(dá)水平，促進(jìn)新生血管形成過程，減低IL-1β和TNF-α等炎癥因子的釋放，從而有效降低了由此所導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。除此之外，七氟醚和芬太尼還能夠減少海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步減輕了認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。

[1] Grape S, Ravussin P, Rossi A, et al. Postoperative cognitive dysfunction[J]. Trends Anaesthesia Critical Care,2012,2(3):98-103.

[2] Xu B, Yang J, Kang F, et al. The inflammatory response of two different kinds of anesthetics on vascular cognitive impairment rats and the effect on long term cognitive function[J]. Int J Clin Exp Med,2015,8(9):16694-8.

[3] Takahashi K, Funata N, Ikuta F, et al. Neuronal apoptosis and inflammatory responses in the central nervous system of a rabbit treated with Shiga toxin-2[J]. J Neuroinflammation,2008,5:11.

[4] Wan Y, Xu J, Ma D, et al. Postoperative impairment of cognitive function in rats: a possible role for cytokine-mediated inflammation in the hippocampus[J]. Anesthesiology,2007,106(3):436-43.

[5] Rosezyk H A, Sparkman N L, Johnson R W. Neuroinflammation and cognitive functioning aged mice follow minor surgery[J]. Exp Gerontol,2008,43(9):840-6.

[6] O’Brien J T, Erkinjuntti T, Reisberg B, et al. Vascular cognitive impairment[J]. Lancet Neurol,2003,2(2): 89-98.

[7] Román G C, Sachdev P, Royall D R, et al. Vascular cognitive disorder: a new diagnostic category updating vascular cognitive impairment and vascular dementia[J]. J Neurol Sci,2004,226(1-2): 81-7.

[8] Sun L, Xie K, Zhang C, et al. Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates postoperative cognitive impairment in aged rats[J]. Neuroreport,2014, 25(9): 718-24.

[9] Arora S S, Gooch J L, García P S. Postoperative cognitive dysfunction, Alzheimer's disease, and anesthesia[J]. Int J Neurosci,2014, 124(4): 236-42.

[10] Daulatzai M A. Fundamental role of pan-inflammation and oxidative-nitrosative pathways in neuropathogenesis of Alzheimer’s disease in focal cerebral ischemic rats[J]. Am J Neurodegener Dis,2016, 5(2): 102-30.

[11] Guo M F, Yu J Z, Ma C G. Mechanisms related to neuron injury and death in cerebral hypoxic ischaemia[J]. Folia Neuropathol,2011,49(2):78-87.

[12] Zhang Z, Li X, Li F, et al. Berberine alleviates postoperative cognitive dysfunction by suppressing neuroinflammation in aged mice[J].Int Immunopharmacol,2016, 38: 426-33.