李能干，范新萍，趙榮，李培，譚姿輝，劉家恩，李存璽*

（1北京家恩德運(yùn)醫(yī)院家恩遺傳實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院，北京100020；3北京家恩德運(yùn)醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100191）

女性2條X染色體中，其中1條發(fā)生等臂雙著絲粒重排，會(huì)導(dǎo)致X染色體短臂及著絲粒至長(zhǎng)臂斷點(diǎn)部分的片段局部三體與X染色體長(zhǎng)臂斷點(diǎn)至長(zhǎng)臂末端的片段局部單體。除了等臂雙著絲粒X染色體的細(xì)胞系之外，該類患者還可能嵌合攜帶45，X及46，XX細(xì)胞系。等臂雙著絲粒X染色體在其長(zhǎng)臂上的斷點(diǎn)常見(jiàn)于Xq13、Xq21、Xq22、Xq27、Xq28等。由于嵌合程度以及斷點(diǎn)位置的不同，患者的臨床特征從正常女性、不同程度的特納綜合征特性，到嚴(yán)重的性腺發(fā)育不良（包括卵巢子宮完全缺如等）等。我們發(fā)現(xiàn)1例14歲女性特納綜合征體貌較為明顯，染色體分析提示純合46, X, psu idic(Xq)核型，染色體熒光原位雜交（FISH）及微陣列芯片技術(shù)（chromosome microarray assay, CMA）檢測(cè)確證攜帶等臂假雙著絲粒X染色體。

對(duì)象與方法

1 病歷

患者，女，14歲，身高140cm，于2014年8月因第二性征發(fā)育遲緩就醫(yī)。B超結(jié)果示盆腔未見(jiàn)子宮樣回聲（圖1A），雙側(cè)卵巢缺如（圖1B）。在本院遺傳咨詢中，發(fā)現(xiàn)患者特納綜合征體貌明顯，考慮性染色體異常的可能性，建議進(jìn)一步檢測(cè)確認(rèn)。

2 染色體核型檢測(cè)

在患者及家屬知情同意的原則下，無(wú)菌抽取外周血3ml，肝素鋰抗凝。將適量外周血樣本接種到外周血專用HD培養(yǎng)基內(nèi)，5% CO2，37℃培養(yǎng)72h。收獲細(xì)胞前用0.2μg/ml秋水仙素處理20min；離心去上清液，低滲處理15min；固定 (乙酸∶甲醇=1∶3)，離心去上清液，加新鮮固定液制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液滴在潔凈濕冷的玻片上，風(fēng)干后移入烤箱，90℃烘烤2h。經(jīng)過(guò)胰酶消化、吉姆薩染色，加蓋玻片晾干。細(xì)胞遺傳學(xué)分析用HD系列試劑均為北京家恩遺傳實(shí)驗(yàn)室自制。將制備好的玻片用Leica全自動(dòng)玻片掃描系統(tǒng)GSL-120掃描拍攝，獲得分散的分裂中期染色體圖像。用CytoVision軟件輔助分析判讀中期細(xì)胞，核型分析，歸納結(jié)果。

圖1 患者盆腔超聲檢測(cè)。A，未見(jiàn)子宮樣回聲；B，雙側(cè)卵巢未顯示Fig.1 Ultrasound examination of the patient’s pelvis. A, no uterine echo; B, no bilateral ovaries echo

3 染色體熒光原位雜交

為確認(rèn)核型分析發(fā)現(xiàn)的X染色體異常，對(duì)含中期和間期的混合細(xì)胞懸液用X染色體著絲粒探針Xcen進(jìn)行FISH驗(yàn)證 。懸浮細(xì)胞常規(guī)滴片，風(fēng)干，95℃，5min烤片；37℃ 2×SSC，3 min，兩次；70%、85%、100%乙醇順序脫水各1min，室溫晾干；浸入70%甲酰胺（預(yù)熱），73℃，5min；玻片70%、85%、100%乙醇順序脫水各2min，室溫晾干；加探針Vysis X-green 3μl樣本區(qū)域/玻片；加10mm圓蓋片，塑料水泥密封；雜交：37℃濕盒、避光、過(guò)夜；洗片：0.4×SSC/0.3% NP-40，73℃，2 min；2×SSC，30s；70%、85%和100%乙醇順序脫水各1min，室溫晾干；風(fēng)干，4μl DAPI，加22mm×22mm蓋片，指甲油封片；在熒光顯微鏡下觀察信號(hào)。

4 染色體微陣列芯片分析

使用 QIAamp DNA Blood mini kit（Qiagen，DEU）試劑盒提取外周血基因組 DNA，所得DNA樣本使用Nanodrop 2000 （Thermo，USA）進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)，并稀釋至50ng/μl后待檢。選用包含260萬(wàn)個(gè)拷貝數(shù)標(biāo)記探針和75萬(wàn)個(gè)單核苷多態(tài)性（SNP）探針的CytoScan HD (Affymetrix，USA)芯片，對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè)。按照Affymetrix公司的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對(duì)樣本進(jìn)行酶切、連接、擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)控、純化、定量、片段化、片段化產(chǎn)物質(zhì)控以及標(biāo)記操作。標(biāo)記產(chǎn)物注入芯片后，50℃，60r/min雜交16h后進(jìn)行洗滌和染色。染色后芯片掃描完成后，利用Chromosome Analysis Suite (ChAS)軟件行對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（參見(jiàn)制造商操作說(shuō)明書(shū)）。

結(jié) 果

1 1條等臂假雙著絲粒X染色體核型

患者外周血樣本經(jīng)過(guò)72h培養(yǎng)，制片拍攝200個(gè)中期分裂相細(xì)胞。詳細(xì)分析 100 個(gè)中期分裂相細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)1個(gè)純合的異?？寺。涮卣鳛椋?條X染色體以其長(zhǎng)臂2區(qū)2帶1亞帶為斷點(diǎn)，包含著絲粒的一側(cè)發(fā)生復(fù)制并形成等臂雙著絲粒染色體，其中一個(gè)著絲粒膨大失活。結(jié)果導(dǎo)致Xpter-Xq22.1局部三體，Xq22.1-Xqter局部單體（X染色體長(zhǎng)臂片段缺失）（圖2A）。ISCN格式的核型書(shū)寫(xiě)為：46，X，psu idic(X)(q22.1)[100]。

2 存在3個(gè)X染色體著絲粒，其中2個(gè)在同一條染色體上

為了確認(rèn)核型分析發(fā)現(xiàn)的X染色體異常，對(duì)含中期和間期的混合細(xì)胞用X染色體著絲粒探針Xcen進(jìn)行了FISH驗(yàn)證。結(jié)果顯示，間期細(xì)胞中，均可見(jiàn)3個(gè)X染色體著絲粒信號(hào)；中期細(xì)胞中，同樣可見(jiàn)3個(gè)X染色體著絲粒信號(hào)，其中2個(gè)信號(hào)位于同一條染色體上（圖2B）。按照ISCN規(guī)則，F(xiàn)ISH臨床報(bào)告為：ish idic(X)(q22.1)(DXZ1++)[20].nuc ish(DXZ1×3)[200]。

3 X短臂末端至長(zhǎng)臂q22.1重復(fù)、長(zhǎng)臂q22.1至長(zhǎng)臂末端缺失

圖2C展示被檢者CMA檢測(cè)結(jié)果所得的虛擬染色體女性核型，紅色標(biāo)記提示單拷貝缺失區(qū)，藍(lán)色標(biāo)記提示重復(fù)區(qū)。結(jié)果顯示，X染色體短臂pter至 長(zhǎng) 臂 q22.1（chrX：168546-99842711 ×3）重復(fù)。X染色體長(zhǎng)臂q22.1-qter（chrX：99842717-155233846 X1）缺失。此結(jié)果與核型分析所見(jiàn)的X染色體發(fā)生等臂假雙著絲粒重排相符。CMA結(jié)果顯示斷裂和連接點(diǎn)可能位于Xq22.1區(qū)域內(nèi)的99842711 和99842717（CAATGAC）2個(gè)C堿基之間的5個(gè)堿基中。按照ISCN規(guī)則，CMA結(jié)果為：arr[hg19] Xp22.33q22.1(168,546-99,842,711)×3,X-q22.1q28(99,842,717-155, 233,846)×1。

圖2 染色體核型、FISH及CMA。A，核型分析：左側(cè)為患者X染色體，紅色箭頭示idic(X)的斷點(diǎn)，右側(cè)為對(duì)應(yīng)的550條帶水平(bands per haploid set，簡(jiǎn)稱bphs)的染色體模式圖；B，間期細(xì)胞和中期細(xì)胞的FISH檢測(cè)，綠色為X染色體著絲粒探針信號(hào)；C， CMA，示X短臂末端至長(zhǎng)臂q22.1局部三體、長(zhǎng)臂q22.1至長(zhǎng)臂末端局部單體Fig.2 Karyotyping, FISH, and CMA results of the chromosomes. A, karyotyping∶ on the left was the structure of idic(X) , the breakpoint of idic(X) was pointed by the red arrow; on the right was the schematic diagram at the corresponding 550 bphs level; B, FISH examination of interphase and metaphase cells, the green signals indicating centromeres probe signals in the X chromosome; C, CMA showing the trisomy of Xpter-Xq22.1 and monosomy of Xq22.1-Xqter

討 論

典型特納綜合征(Turner syndrome, TS)患者的染色體核型是45,X，約占50%。TS有多種變種，除1條正常的X染色體外，另一條X染色體并非丟失，而是發(fā)生結(jié)構(gòu)畸變，包括del(X)、r(X)、idic(X)、i(X)、X與常染色體的平衡易位等等。TS變種中的異常細(xì)胞系可以是純合的，也可能伴隨45,X或46,XX細(xì)胞系成為嵌合體。核型為idic(X)的TS患者非常少見(jiàn)，在活產(chǎn)女?huà)胫邪l(fā)生率約為1/13 000，多數(shù)以45,X/46,X,idic(Xq)嵌合形式出現(xiàn)[1-6]。純合idic(Xq)的患者相對(duì)更少[7-9]。對(duì)本例患者100個(gè)中期淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析，核型結(jié)果為純合的46,X,psu idic(X)(q22.1)。

一般來(lái)說(shuō)，idic(Xq)導(dǎo)致X染色體整條短臂及部分長(zhǎng)臂局部三體，位于Xpter的PAR1區(qū)（Pseudoautosomal region 1）內(nèi)的SHOX基因劑量比正常女性細(xì)胞增加了50%，常導(dǎo)致攜帶者身高偏高[10]。Seo等報(bào)道一例30歲攜帶46,X,psu idic(X)(q21.2)核型患者，身高達(dá)到190cm[9]。Nishi等報(bào)道一例16歲患者，核型為45,X/46,X,psu idic(X)(pter→q21∶∶q21→pter) ，身高183cm[5]。但SHOX基因的劑量效應(yīng)并非絕對(duì)，常與雌激素水平共同決定患者身高[10]。Tsai等報(bào)道一例9歲患者，核型46,X,idic(X)(q24)，身高143cm，身高在正常范圍內(nèi)[8]。Tsutomu等也報(bào)道一例20歲患者，核型45,X[28]/46,X,psu idic(X)(q28)[72]嵌合體，三倍型SHOX基因占72%，身高162cm[4]。國(guó)內(nèi)馬洪星等報(bào)道一例17歲患者，核型為45,X[29]/46,X,psu dic(X)(q22)[21]的嵌合體，身高150cm，兩側(cè)乳房未發(fā)育，卵巢未探及，子宮發(fā)育不良[6]。Van等報(bào)道的兩例患者核型均為46,X,psu idic(X)(q21.1)，一人13歲身高141cm，另一人12歲半身高142cm，均低于正常水平[7]。Xq局部三體與單體，還影響到位于Xq13.2上的X染色體去活化中心(X inactivation center, XIC)以及XIST基因的拷貝數(shù)，而XIST基因的完整性對(duì)異常X染色體的滅活狀態(tài)有決定作用[7,11]。本例攜帶純合46,X,psu idic(X)(q22.1)核型，3倍型SHOX基因，無(wú)45,X細(xì)胞系嵌合，身高偏矮。因此，評(píng)估idic(X)患者身高和生殖能力，不僅考慮SHOX基因的倍數(shù)，還必須確定是否嵌合45,X細(xì)胞和是否影響XIST的X染色體滅活活性。

X染色體長(zhǎng)臂Xq13-q22、Xq22-q26被認(rèn)為是女性性腺發(fā)育的兩個(gè)關(guān)鍵區(qū)[11,12]，本例患者X染色體形成等臂衍生染色體導(dǎo)致的長(zhǎng)臂片段缺失，覆蓋了第二個(gè)關(guān)鍵區(qū)，可能是患者性腺發(fā)育不良的直接原因。

當(dāng)G顯帶核型分析的顯帶水平達(dá)到550條帶，idic(X)結(jié)構(gòu)畸變并不難檢出。如果染色體顯帶水平過(guò)低，則可能發(fā)生漏診和誤診，需要結(jié)合FISH或CMA方可保證診斷的正確率。在新生兒階段，甚至在產(chǎn)前診斷中盡早發(fā)現(xiàn)idic(X)等X染色體異常，患者便可以在醫(yī)生指導(dǎo)下，使用重組人生長(zhǎng)激素 (recombinant human growth hormone，rhGH)、促性腺激素釋放激素類似物(gonadotrophins releasing hormone analog，aGnRH)等[13]，促進(jìn)性腺發(fā)育、改善第二性征，可能極大提高患者的生活質(zhì)量。