黎智文 代俊杰 李 曉

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羊肚菌干子實體組織分離與孢子分離獲得菌種的比較試驗

黎智文 代俊杰 李 曉*

（吉林農(nóng)業(yè)大學 食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

對干子實體組織分離與孢子分離兩種方法獲得羊肚菌菌種進行比較試驗的結果：萌發(fā)可純化時間分別為1～5天和2～5天；孢子萌發(fā)率較組織的萌發(fā)率高，分別為90%和80%；在萌發(fā)可純化時間內(nèi)，能純化出羊肚菌菌絲的幾率均為100%。

干羊肚菌；組織分離；孢子分離；菌種萌發(fā)

羊肚菌因其菌蓋似羊肚而得名，俗稱羊肚菜、羊肚子、羊肚蘑，是珍貴的食藥用真菌[1，2]。近年來羊肚菌在我國已進行了大面積季節(jié)性人工栽培[3]，產(chǎn)量和質量逐年提高。

因羊肚菌屬于子囊菌，菌種退化速度快，需要經(jīng)常制種[4]。本文對兩種簡單、快速、可周年化生產(chǎn)的羊肚菌菌種獲得方法進行比較，為簡化菌種生產(chǎn)環(huán)節(jié)提供參考。

1 試驗材料

干羊肚菌子實體，為田間選擇的理想的置于戶外陽光下曬干或自然風干的羊肚菌子實體；或為經(jīng)曬干或風干后保藏的不發(fā)潮、不霉變的子實體。羊肚菌孢子由田間選擇采收的八分熟羊肚菌子實體直接置于室內(nèi)桌面的黑紙上過夜后收集獲得，保藏備用。

其他試驗材料和工具包括鑷子、裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿、空培養(yǎng)皿、封口膜、75%酒精、酒精燈和超凈工作臺等。

2 試驗方法

2.1 PDA平板培養(yǎng)基的制作

以制作1 000 mL培養(yǎng)基為例：稱取馬鈴薯200 g，切塊置于1 000 mL水中煮至半熟，紗布過濾，得濾液。邊加熱濾液邊倒入20 g瓊脂粉攪拌均勻，瓊脂粉全溶解后倒入20 g葡萄糖和2 g MgSO4。將所得液體分裝到三角瓶中，與報紙包好的培養(yǎng)皿一起經(jīng)121 ℃高壓滅菌30 min。滅菌后，在超凈工作臺中每個培養(yǎng)皿倒入約15 mL的PDA培養(yǎng)液，冷卻后備用。

2.2 菌種制作方法

（1）組織分離。將一個空培養(yǎng)皿、無菌水、75%酒精、PDA平板培養(yǎng)基、接種用具等放入超凈工作臺中紫外滅菌30分鐘，然后，放入干羊肚菌子實體和含有羊肚菌孢子的紙條。雙手經(jīng)75%酒精消毒后，點燃酒精燈，打開空培養(yǎng)皿倒入適量的75%酒精，鑷子經(jīng)火焰滅菌，待冷卻后于菌柄上夾取高粱粒大小的菌肉，放入培養(yǎng)皿中浸泡1 min左右，再放入PDA平板培養(yǎng)基中間位置。每個培養(yǎng)基放一塊菌肉，根據(jù)所分離子實體的部位、制種數(shù)量等的需求，接種足夠數(shù)量的培養(yǎng)基。接種后，用封口膜封好，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中無光培養(yǎng)2～5天，菌肉上長出可純化使用的菌絲[5～10]。

（2）多孢分離。試驗準備工作與組織分離類似，鑷子過無菌水濕潤后粘取羊肚菌孢子涂布到PDA平板培養(yǎng)基上，用封口膜密封。置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中無光培養(yǎng)。約1～5天，孢子即可萌發(fā)出可純化的菌絲。

（3）純化保藏。按照無菌操作流程，挑取以上兩種方法獲得的較尖端的無污染菌絲，轉接到未接菌的PDA平板培養(yǎng)基中，封口、培養(yǎng)。培養(yǎng)期間剔除污染平板培養(yǎng)基，待平板培養(yǎng)基有菌核形成時，按無菌操作規(guī)程將菌核接入PDA試管培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)、篩選、保藏后，作為羊肚菌實驗或生產(chǎn)使用的菌種。

3 結果與分析

試驗結果：①萌發(fā)可純化時間是指菌體組織或其孢子在萌發(fā)出菌絲后可用于純化使用的時間，本試驗羊肚菌組織分離方法與孢子分離方法的萌發(fā)可純化時間分別為1～5天和2～5天。到第5天后，菌絲與雜菌皆長滿培養(yǎng)皿，此時不利于純化使用；②萌發(fā)率是指所接的羊肚菌組織或所有的孢子能完好萌發(fā)的概率。試驗中，孢子萌發(fā)率較組織萌發(fā)率高，分別為90%和80%；③純化出菌絲幾率是指在萌發(fā)可純化時間內(nèi)的所有適當時間點能純化出羊肚菌菌絲的幾率，經(jīng)測試兩種方法均為100%。

干羊肚菌組織分離成功的關鍵在于選擇干凈無污染、無霉變、潔白或微黃的理想子實體，以及從鮮品到干品的處理過程無機械壓傷，無化學污染等。孢子分離的關鍵在于選用子實體的成熟度高及收集孢子時子實體所處的環(huán)境條件適宜[11]。

4 討 論

羊肚菌子實體可以干制，干制后其菌絲、孢子皆處于休眠狀態(tài)，在適宜的條件下可以再次萌發(fā)成菌絲。利用此屬性，可以周年化生產(chǎn)、保藏羊肚菌菌種，使羊肚菌周年化研究、生產(chǎn)成為可能。

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[4] 劉偉, 張亞, 蔡英麗. 我國羊肚菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀及趨勢[J]. 食藥用菌, 2017, 25(2): 77-83.

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[11] 陳易飛. 羊肚菌子囊孢子釋放機理初探[J]. 中國食用菌, 2001, 20: 53-54.

黎智文、代俊杰，吉林農(nóng)業(yè)大學在讀碩士研究生，研究方向為食用菌栽培與育種，E-mail：1134861016@qq.com。

，E-mail：lxmogu@163.com。

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