俞商婷 宋婷婷 金群力 馮偉林 余敏佳 蔡為明

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桑黃燕麥固體發(fā)酵菌質(zhì)多酚含量及其抗氧化活性分析

俞商婷 宋婷婷 金群力 馮偉林 余敏佳 蔡為明*

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，浙江 杭州 310021）

利用燕麥作為基質(zhì)對(duì)桑樹桑黃菌絲進(jìn)行固體發(fā)酵，測(cè)定固體發(fā)酵菌質(zhì)中的多酚含量及其抗氧化活性，研究分析固體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間、通氣培養(yǎng)條件與多酚含量及其抗氧化能力的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果：固體發(fā)酵不同培養(yǎng)時(shí)間和滿瓶后不同通氣培養(yǎng)條件對(duì)菌質(zhì)中的多酚含量及其抗氧化活性的影響顯著，桑黃固體發(fā)酵最佳條件為滿瓶后開蓋繼續(xù)培養(yǎng)7～14 d。

桑黃；營(yíng)養(yǎng)成分；抗氧化；栽培

隨著社會(huì)的進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民的生活水平逐漸提高，保健品的需求量也在逐漸增加。桑黃在我國(guó)已有2 000多年的藥用歷史，最早在《神農(nóng)百草經(jīng)》和《本草綱目》中記載為“桑耳”。主治血崩、血淋、脫肛止血、閉經(jīng)、脾虛泄瀉等，現(xiàn)代藥理研究表明，桑黃具抗腫瘤、保肝、降血糖等作用，還有良好的抗氧化能力，是一種潛在的抗氧化天然藥物[1]。桑黃功效成分主要有多酚類、三萜和黃酮類物質(zhì)。多酚類物質(zhì)具有較高的抗氧化活性，通過(guò)還原作用清除人體內(nèi)的氧自由基，還能抗腫瘤，增強(qiáng)免疫力，促進(jìn)細(xì)胞分化。

大量報(bào)道顯示，食用菌菌絲體與子實(shí)體具有相似種類和相近含量的營(yíng)養(yǎng)成分[2,3]。因此通過(guò)固體發(fā)酵的方式，既可以縮短生產(chǎn)周期，又可獲得大量更為穩(wěn)定的功效成分。燕麥作為一種粗糧，由于具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，越來(lái)越被國(guó)人重視。燕麥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不但體現(xiàn)在具有豐富的蛋白質(zhì)、油脂，更重要的是，富含豐富的膳食纖維和極高的抗氧化性[4]。本試驗(yàn)利用燕麥作為培養(yǎng)基進(jìn)行桑黃菌絲體的固體發(fā)酵，測(cè)定了以燕麥為基質(zhì)的桑黃固體發(fā)酵菌質(zhì)中的多酚含量，并研究分析了固體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)條件對(duì)多酚含量及其抗氧化能力的影響，以期獲得更高抗氧化活性桑黃固體發(fā)酵產(chǎn)物。

1 試驗(yàn)材料

供試桑黃菌株由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供。試驗(yàn)試劑有總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、乙醇、Dpph、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、ABTS、過(guò)硫酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉和福林酚，以上試劑均為分析純。儀器為電子天平，恒溫水浴鍋，電磁爐，離心機(jī)，超聲波清洗器，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)，分光光度計(jì)，勻漿儀等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 桑黃燕麥固體發(fā)酵

（1）桑黃液體菌種培養(yǎng)。將桑黃斜面活化母種接種到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為23～28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為8～10 d，得到桑黃菌塊。取邊緣橫截面直徑為1 cm的桑黃菌塊接種到裝有50～100 mL PD液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，將其置于搖床內(nèi)進(jìn)行恒溫發(fā)酵培養(yǎng)。搖床旋轉(zhuǎn)頻率為90～110 r/min，培養(yǎng)溫度為23～28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為10～15 d，得到桑黃液體菌種。培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)瓶為三角瓶。

（2）燕麥培養(yǎng)基制作。燕麥經(jīng)冷水洗凈后置于沸水中浸泡25～35 min吸足水分，然后倒入篩籃內(nèi)靜置1～2 h，瀝干。得到的燕麥固體培養(yǎng)基的水分含量為45%～50%，將130±5 g燕麥固體培養(yǎng)基裝入直徑6 cm、高9 cm植物培瓶，于121℃的溫度下滅菌1.5～2 h。

（3）接種與固體發(fā)酵培養(yǎng)。將桑黃液體菌種用勻漿儀進(jìn)行勻漿，每開機(jī)勻漿3～5 s靜置30～50 s，連續(xù)重復(fù)操作2～4次，得到菌絲體勻漿液，隨后將菌絲體勻漿液按1︰8～1︰12的接種量接種到燕麥固體培養(yǎng)基內(nèi)，于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23～28 ℃。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間處理。進(jìn)行不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)固體發(fā)酵菌質(zhì)多酚含量及抗氧化活性的影響試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)菌絲長(zhǎng)滿半瓶、全瓶，以及滿瓶后繼續(xù)培養(yǎng)7 d、14 d和50 d ，共5個(gè)處理，分別取菌質(zhì)樣品進(jìn)行分析。

（5）通氣條件處理。菌絲長(zhǎng)滿瓶后，設(shè)開蓋培養(yǎng)和不開蓋培養(yǎng)2種不同通氣條件繼續(xù)培養(yǎng)處理，分別在處理前和處理后7 d、14 d和50 d取菌質(zhì)樣品進(jìn)行分析。

（6）桑黃燕麥固體發(fā)酵菌質(zhì)樣品制備。將不同試驗(yàn)處理固體發(fā)酵菌質(zhì)樣品置于50～60 ℃烘箱中烘干，然后粉碎，得到的粉末過(guò)100～200目篩備用。

2.2 樣品中多酚的提取

稱取1.000 g樣品，加入25 mL95%乙醇，用旋窩震蕩儀混勻，置于超聲波清潔儀中30 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液。用快速過(guò)濾紙過(guò)濾到50 mL定容瓶中。再在原管中加入25 mL95%乙醇，重復(fù)上述步驟一次，將過(guò)濾液收集到50 mL的定容瓶之后，用95%乙醇定容到刻度。獲得的提取物備用于多酚含量和抗氧化活性測(cè)定。

2.3 總酚含量測(cè)定

精準(zhǔn)吸取1 mL固體發(fā)酵提取物加入1 mL10%福林酚試劑劇烈反應(yīng)3 min后加入3 mL15%碳酸鈉溶液靜置2 h，在760 nm下測(cè)定吸光值。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量：

式中，為總酚含量；為測(cè)定吸光值；為相關(guān)系數(shù)。

2.4 抗氧化能力評(píng)價(jià)

采用總抗氧化能力、自由基清除率DPPH、ABTS+清除率3種方法來(lái)評(píng)價(jià)不同處理固體發(fā)酵菌質(zhì)中多酚的抗氧化活性。

（1）總抗氧化能力（TOC）測(cè)定。采用總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）測(cè)定，步驟參考試劑盒說(shuō)明。

（2）自由基清除率（DPPH）測(cè)定。從試管中準(zhǔn)確移取濃度為0.01%的DPPH 2.5 mL到0.5 mL固體發(fā)酵提取物中，搖勻，避光反應(yīng)30 min，在517 nm下測(cè)定其吸光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同固體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌質(zhì)中多酚含量及抗氧化活性的影響

隨著固體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的推進(jìn)，菌質(zhì)中的多酚含量逐漸升高。在菌絲長(zhǎng)滿瓶后繼續(xù)培養(yǎng)14 d時(shí)多酚含量達(dá)最高值，隨后下降（圖1a）。

TOC活性在菌絲滿瓶后隨著時(shí)間的加長(zhǎng)而逐漸增加，滿瓶后7～14 d，TOC活性快速增長(zhǎng)，第14 d后增長(zhǎng)變慢，繼續(xù)培養(yǎng)至50 d時(shí)TOC活力最強(qiáng)（圖1b）。

DPPH清除率在接種后快速增長(zhǎng)，在滿瓶后第7 d出現(xiàn)最高值，隨后逐漸降低（圖1c）。

ABTS+清除率在菌絲接種后開始增長(zhǎng)，未開蓋處理的菌質(zhì)清除率緩慢增長(zhǎng)。在滿瓶后第50 d出現(xiàn)最高值。滿瓶后開蓋處理的菌質(zhì)清除率快速增長(zhǎng)，在滿瓶后第7 d出現(xiàn)最高值，隨后略微下降（圖1d）。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間和通氣處理的桑黃固體發(fā)酵菌質(zhì)多酚含量和抗氧化活性

3.2 不同通氣培養(yǎng)條件對(duì)固體發(fā)酵菌質(zhì)多酚含量及其抗氧化活性的影響

菌絲滿瓶后，開蓋培養(yǎng)處理的菌質(zhì)中多酚含量比不開蓋培養(yǎng)處理高25%～34%，差異顯著（<0.05）（圖1a）。

TOC活性在滿瓶開蓋后至繼續(xù)培養(yǎng)14 d，呈直線增長(zhǎng)；而后隨著培養(yǎng)時(shí)間加長(zhǎng)，增長(zhǎng)速率減慢，繼續(xù)培養(yǎng)至50 d時(shí)出現(xiàn)最高值（圖1b）。

DPPH清除率，總的來(lái)說(shuō)，開蓋和不開蓋處理差異性不顯著，呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。在滿瓶后7 d達(dá)到高峰值，隨后開始逐漸降低（圖1c）。

ABTS+清除率在菌絲滿瓶開蓋處理后迅速增長(zhǎng)，不開蓋則沒(méi)有顯著變化。在菌絲滿瓶開蓋至培養(yǎng)第7 d快速增長(zhǎng)并出現(xiàn)最高值，隨后清除率略有降低（圖1d）。

4 討 論

生物機(jī)體在正常代謝中會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫、超氧陰離子等自由基，從而導(dǎo)致機(jī)體過(guò)氧化，對(duì)脂類、蛋白質(zhì)、核酸造成損傷，從而引發(fā)機(jī)體衰老、肝硬化、糖尿病、風(fēng)濕等疾病[5]。大量研究報(bào)道說(shuō)明，桑黃中的多酚類物質(zhì)具有良好的抗氧化能力，其中黃酮類具有抗氧化活性和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用。桑黃以其顯著的抗氧化能力，成為繼靈芝后食藥用菌的又一大熱點(diǎn)[6]。目前，國(guó)內(nèi)外已開發(fā)出基于子實(shí)體和提取物的系列保健產(chǎn)品。在韓國(guó)，桑黃提取物干粉每克售價(jià)高達(dá)2 000美元。由于人工栽培桑黃產(chǎn)量有限，品質(zhì)受栽培基質(zhì)、環(huán)境等因素影響大，固體發(fā)酵可實(shí)現(xiàn)批量化、穩(wěn)定化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。本試驗(yàn)對(duì)以燕麥為基質(zhì)的桑黃固體發(fā)酵菌質(zhì)中的多酚含量及其抗氧化活性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，固體發(fā)酵不同培養(yǎng)時(shí)間和滿瓶后不同通氣培養(yǎng)條件對(duì)菌質(zhì)中的多酚含量及其抗氧化活性的影響顯著，桑黃固體發(fā)酵最佳條件為滿瓶后開蓋繼續(xù)培養(yǎng)7～14 d。開蓋處理對(duì)菌質(zhì)抗氧化活性的影響的主要機(jī)理有待后續(xù)研究。

[1] 劉凡, 龐道睿, 鄒宇曉, 等. 桑黃總黃酮含量及其體外抗氧化活性研究[J]. 中國(guó)食用菌, 2014, 33(2): 47-49.

[2] 饒毅萍, 陳潔輝, 張冰娜, 等. 平菇菌絲體與子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)成分的分析比較[J]. 生物學(xué)雜志, 2011, 28(3): 94-96.

[3] 呂喜茹, 郭亮, 常明昌, 等. 姬松茸粗多糖抗氧化作用[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 2010, 17(1): 69-71.

[4] 汪海波, 謝筆鈞, 劉大川. 燕麥中抗氧化成分的初步研究[J]. 食品科學(xué), 2003, 24(7): 62-67.

[5] 昝立峰, 包海鷹, 李丹花. “桑黃”類真菌中多酚物質(zhì)及其生物活性研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2016, 28: 147-155.

[6] 史幀婷, 包海鷹. 桑黃類真菌有效成分及功效研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2016(11): 197-202.

食用菌新品種選育（編號(hào)：2016C02057）；食用菌產(chǎn)業(yè)（桑黃）食字號(hào)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)與中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究（編號(hào)：CA20170003）

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2095-0934（2018）02-084-04