司超，劉瑋，劉俊，李霞斌，姚輝華,(西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000；成都市第一人民醫(yī)院；西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

慢性HBV感染是我國肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌)的主要致病原因，HBV DNA編碼的X蛋白(HBX)與HBV感染致癌緊密相關(guān)[1,2]。乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白(HBXIP)作為HBX蛋白的作用因子，通過與HBX和survivn形成復(fù)合物調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，并在多種惡性腫瘤中表達(dá)顯著增強(qiáng)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和患者預(yù)后密切相關(guān)[3]。Caspase 9作為一種凋亡促進(jìn)蛋白，位于Caspase級聯(lián)反應(yīng)的上游，是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵因子。本研究觀察了HBXIP與Caspase 9在肝癌組織中的表達(dá)，現(xiàn)分析結(jié)果并探討二者在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年12月～2017年4月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的、行手術(shù)治療的肝癌患者54例，男45例、女 9例，年齡36～73(48.67±9.32)歲；HBsAg陽性 49例，血清AFP≥400 μg/L 24例、<400 μg/L 30 例，伴肝硬化27例。肝功能Child-Pugh分級為A級47例、B級7例。術(shù)前均未接受放化療等輔助治療。術(shù)后病理證實(shí)為肝細(xì)胞癌，單個病灶43例、多個病灶11例，腫瘤直徑≤5 cm 21例、>5 cm 33例，包膜完整34例、無包膜或包膜不完整 20例，轉(zhuǎn)移14例，癌栓形成 19例，按照2010年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(UICC/AJCC)第七次修訂的TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期20例；高、中分化37例，低分化17 例。術(shù)中留取肝癌組織54例份(肝癌組)及手術(shù)切緣無腫瘤細(xì)胞浸潤的癌旁正常組織29例份(癌旁組)。另選取同期因肝臟良性疾病行手術(shù)切除的正常肝組織15例份(對照組)，患者男5例、女10例，年齡36～80(62.07±12.18)歲，肝囊腫14例、肝血管瘤1例。

1.2 肝組織HBXIP、Caspase 9蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化Envision法。取三組標(biāo)本，經(jīng)中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚切片，采用EDTA修復(fù)液高溫高壓修復(fù)抗原，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。以預(yù)實(shí)驗(yàn)中HBXIP和Caspase 9陽性的肝癌切片作為陽性對照，以PBS液代替一抗作為陰性對照。HBXIP兔抗人單克隆抗體購自美國Cst公司，Caspase 9兔抗人單克隆抗體購自英國Abcan公司，EDTA修復(fù)液購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。HBXIP和Caspase 9陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞呈黃色或棕黃色為陽性。由兩位病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片，根據(jù)染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度：細(xì)胞無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞數(shù)：≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。將染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)的評分相加，總評分<2分為陰性、≥2分為陽性[4,5]。分析肝癌組織HBXIP與Caspase 9表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系及二者的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組HBXIP、Caspase 9表達(dá)比較 HBXIP陽性表達(dá)率：肝癌組、癌旁組與對照組分別為72.2%(39/54)、48.3%(14/29)、33.3%(5/10)；肝癌組明顯高于癌旁組及對照組(P均<0.05)。Caspase 9陽性表達(dá)率：肝癌組、癌旁組織與對照組分別為38.9%(21/54)、62.1%(18/29)、80.0%(12/15)；肝癌組明顯高于癌旁組及對照組(P均<0.05)。

2.2 肝癌組織HBXIP、Caspase 9表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 肝癌組織HBXIP表達(dá)與組織分化程度、癌栓形成、TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，Caspase 9表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和組織分化程度有關(guān)(P均<0.05)。見表1。

2.3 肝癌組織HBXIP與Caspase 9表達(dá)的關(guān)系 肝癌組織中HBXIP表達(dá)陽性39例，其中Caspase 9表達(dá)陽性11例；HBXIP表達(dá)陰性15例，其中Caspase 9表達(dá)表達(dá)陰性5例。Spearman等級相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，肝癌組織HBXIP與Caspase 9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=- 0.353，P=0.009)。

3 討論

HBXIP是從肝癌HepG2細(xì)胞中克隆得到的一種細(xì)胞組成蛋白，可與HBX蛋白羧基末端結(jié)合，負(fù)性調(diào)節(jié)HBX蛋白活性，從而改變HBV的復(fù)制周期[6]。HBXIP在哺乳動物的許多組織中廣泛表達(dá)，尤其是在肌肉組織中顯著高表達(dá)。HBXIP為一種多功能的調(diào)節(jié)蛋白，是多種轉(zhuǎn)錄因子的輔激活因子。其通過多種分子機(jī)制參與調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為：① 與HBX和survivin形成復(fù)合物抑制Caspase 9激活，阻斷Caspase 9介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡線粒體通路[3]。② 上調(diào)細(xì)胞中單純LIM結(jié)構(gòu)域蛋白4、分泌粒蛋白Ⅲ、Lin-28B、YES相關(guān)蛋白、鈣結(jié)合蛋白S100A4等表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[7～10]。③ 與HBX共同定位于中心體的微管上，調(diào)節(jié)中心體的復(fù)制和細(xì)胞分裂[11]。④ 抑制細(xì)胞色素C氧化酶和丙酮酸脫氫酶α1表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的糖異生作用[12]；也可通過激活LXRs/SREBP-1c/FAS信號級聯(lián)，增加細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的合成[13]。近年來研究顯示，HBXIP在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中顯著高表達(dá)，與腫瘤的生長、浸潤轉(zhuǎn)移、血管生成和患者預(yù)后密切相關(guān)[14，15]。在肝癌方面，孫紀(jì)三等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在42例肝癌組織中HBXIP的陽性表達(dá)率為80.95%，明顯高于正常肝組織。本研究結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，在肝癌組織中HBXIP陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織和正常肝組織，提示HBXIP表達(dá)異?？赡茉诟伟┑难葑冞^程中發(fā)揮重要作用，其可能成為肝癌臨床診斷的標(biāo)志物。本研究中，HBXIP在低分化肝癌中的陽性表達(dá)率明顯高于高、中分化組織；TNM分期Ⅲ～Ⅳ期肝癌組織的陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期組織；伴有癌栓形成者的陽性表達(dá)率明顯高于無癌栓形成者。提示HBXIP表達(dá)增強(qiáng)與腫瘤的臨床進(jìn)展和惡性生物學(xué)行為相關(guān)，其表達(dá)變化可在一定程度上反映腫瘤的惡性程度。推測HBXIP表達(dá)升高可能調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)或修飾，從而抑制肝癌細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)其異常增殖、浸潤轉(zhuǎn)移和惡性分化。

注：肝癌組織HBXIP表達(dá)與組織分化程度、癌栓形成、TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，Caspase 9表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和組織分化程度有關(guān)(P均<0.05)。

Caspase 9是一種能夠特異性識別底物中天冬氨酸位點(diǎn)的半胱氨酸蛋白酶，屬于Caspase家族啟動組成員。在細(xì)胞內(nèi)Caspase 9通常以沒有活性的酶原形式存在，當(dāng)線粒體受到凋亡信號刺激后，細(xì)胞色素C被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，并在ATP的參與下與Apaf1和pro-Caspase 9形成復(fù)合物，激活Caspase 9，活化的Caspase 9繼續(xù)激活下游的凋亡效應(yīng)因子Caspase 3、Caspase 7，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織Caspase 9陽性表達(dá)率低于癌旁組織和正常肝組織，提示在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中Caspase 9的表達(dá)受到抑制，致使細(xì)胞凋亡受到抑制，凋亡與增殖之間的平衡被打破，從而增加了肝細(xì)胞惡性改變的機(jī)會，導(dǎo)致肝癌的形成。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Caspase 9在低分化肝癌組織中陽性表達(dá)率明顯低于高、中分化組織，提示正常肝細(xì)胞在向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中可能存在Caspase 9基因表達(dá)的篩選，Caspase 9表達(dá)陽性的肝細(xì)胞容易發(fā)生凋亡而失去表達(dá)，Caspase 9表達(dá)陰性的肝細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力較弱而得以生存下來，發(fā)展成為癌細(xì)胞。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移者Caspase 9陽性表達(dá)率明顯低于無腫瘤轉(zhuǎn)移者，表明Caspase 9表達(dá)下調(diào)與肝癌細(xì)胞的惡性分化和浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)，其可能作為評估肝癌惡性生物學(xué)行為的分子標(biāo)志物。

研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌HepG2細(xì)胞中，HBXIP能夠與HBX和survivin形成復(fù)合物，進(jìn)而抑制Caspase 9激活[3]。但目前尚未見到關(guān)于HBXIP和Caspase 9在肝癌組織中相互作用關(guān)系的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，HBXIP和Caspase 9在肝癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明HBXIP和Caspase 9在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起拮抗作用，進(jìn)一步證實(shí)了在肝癌組織中HBXIP高表達(dá)可能對Caspase 9激活具有抑制作用，通過降低細(xì)胞中Caspase 9表達(dá)，可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖、惡性分化和浸潤轉(zhuǎn)移。

綜上所述，肝癌組織中HBXIP表達(dá)增加、Caspase 9表達(dá)降低，二者的表達(dá)變化可促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

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