袁曉鳳，袁修凱，周芳

(1中國(guó)人民解放軍第97醫(yī)院，江蘇徐州 221000；2睢寧中醫(yī)院)

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞[1,2]。hUC-MSCs取材方便，易于分離培養(yǎng)，低免疫原性低，且遺傳性狀穩(wěn)定[3,4]，故被認(rèn)為是組織工程的理想種子細(xì)胞。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和腫瘤之間具有密切的聯(lián)系[5,6]，卵巢癌是婦產(chǎn)科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于該腫瘤起病比較隱匿，缺乏特異表現(xiàn)，在臨床上確診時(shí)大多已經(jīng)晚期，是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中病死率最高的腫瘤。本研究以卵巢癌細(xì)胞株SKOV3為研究對(duì)象，觀察了卵巢癌細(xì)胞株SKOV3在hUC-MSCs培養(yǎng)液hUC-MSCs培養(yǎng)液中的增殖、凋亡和遷移情況?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料低糖DMEM和高糖DMEM購(gòu)自Gibco公司；血清購(gòu)自Excell公司；小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體(mAb)、小鼠抗大鼠Bcl-2 mAb和小鼠抗大鼠Bax mAb購(gòu)自Immuway公司；MTT四甲基偶氮唑藍(lán)試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；成骨、成脂誘導(dǎo)液以及堿性磷酸酶(ALP)和油紅O染色液購(gòu)自廣州賽業(yè)公司；凋亡試劑盒購(gòu)自Sigma公司；Transwell小室、6孔板、25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自Corning公司；倒置顯微鏡購(gòu)自Nikon公司；二氧化碳孵育箱購(gòu)自Thermo公司。

1.2hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)及hUC-MSCs細(xì)胞培養(yǎng)液的制備在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作，用PBS沖洗掉臍帶表明殘留的血液，在含雙抗(青/鏈霉素，終濃度為100 U/mL)的營(yíng)養(yǎng)液中浸泡約15 min，隨后去掉臍帶組織中的動(dòng)脈和靜脈，將臍帶組織剪成約1 mm3的小塊，小心均勻的貼在10 mm×35 mm小皿中并加入含有雙抗的L-DMEM培養(yǎng)液，放在37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 d換液1次。培養(yǎng)7～10 d可見(jiàn)纖維樣的細(xì)胞從臍帶組織塊中爬出，待細(xì)胞融合到80%時(shí)消化傳代。經(jīng)過(guò)3次傳代純化后收集細(xì)胞備用。將hUC-MSCs細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，更換無(wú)血清的L-DMEM培養(yǎng)液，24 h后提取培養(yǎng)液,0.22 μm濾膜過(guò)濾。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SKOV3細(xì)胞分組及hUC-MSC細(xì)胞培養(yǎng)液應(yīng)用 將體外培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞分為觀察1組、觀察2組和對(duì)照組。觀察1、2組分別用10%、20%的hUC-MSC培養(yǎng)，對(duì)照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4各組SKOV3細(xì)胞增殖情況觀察 ①M(fèi)TT法。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SKOV3接種于96孔板，每孔2 000個(gè)細(xì)胞，然后每孔加入200 μL H-DMEM營(yíng)養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜后，次日換10%、20%的hUC-MSCs培養(yǎng)液(分別計(jì)為觀察1組、觀察2組)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT，37 ℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)4 h后棄掉上清培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO溶液，避光振蕩15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度值。每個(gè)觀察組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。以未經(jīng)hUC-MSCs培養(yǎng)液處理的SKOV3細(xì)胞作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。②細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SKOV3細(xì)胞按500/孔接種于小皿中，用H-DMEM營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜后，換10%、20%的hUC-MSCs培養(yǎng)液(分別計(jì)為觀察1組、觀察2組)，每3天換液1次，第7天棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3遍后4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3遍，結(jié)晶紫染色30 min后PBS沖洗3遍，拍照并記錄細(xì)胞克隆個(gè)數(shù)。以未經(jīng)hUC-MSCs培養(yǎng)液處理的SKOV3細(xì)胞作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5各組SKOV3細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，0.25%胰酶消化計(jì)數(shù)，按每孔加入3×104個(gè)細(xì)胞于6孔板內(nèi)，次日棄去培養(yǎng)液，換10%、20%的hUC-MSCs培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)每管1×106個(gè)細(xì)胞，然后滴加PI和Annexin-V-FITC進(jìn)行雙染，在4 ℃避光染色30 min，過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。以未經(jīng)hUC-MSCs培養(yǎng)液處理的SKOV3細(xì)胞為對(duì)照組。

1.6各組SKOV3細(xì)胞遷移情況觀察 ①劃痕實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SKOV3細(xì)胞按1×105/孔接種于小皿中，置于37 ℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)到細(xì)胞融合度>80%，棄去培養(yǎng)液，用無(wú)血清的H-DMEM營(yíng)養(yǎng)液沖洗3遍，用200 μL移液槍槍頭在小皿中劃出1條直線，再用無(wú)血清的H-DMEM營(yíng)養(yǎng)液沖洗，換10%、20%的hUC-MSCs培養(yǎng)液(分別為觀察1組、觀察2組)，在顯微鏡下觀察并拍照記錄0 h和48 h細(xì)胞遷移情況，計(jì)算0 ～48 h劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h寬度-48 h寬度)/0 h寬度×100%。以未經(jīng)hUC-MSCs培養(yǎng)液處理的SKOV3細(xì)胞為對(duì)照組。②Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。用10%、20%的hUC-MSCs培養(yǎng)液預(yù)處理SKOV3細(xì)胞24 h，分別為觀察1組、觀察2組。以未經(jīng)hUC-MSCs培養(yǎng)液處理的SKOV3細(xì)胞為對(duì)照組。收集各組SKOV3細(xì)胞，用無(wú)血清H-DMEM營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)液重懸后，在Transwell小室中加入細(xì)胞懸液按200 μL，在下室中加入800 μL含10%NBS的H-DMEM營(yíng)養(yǎng)液。置于37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后，取出Transwell小室，吸去上室內(nèi)的液體，棉簽擦去小室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，用PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3遍，結(jié)晶紫染色30 min后PBS沖洗3遍，顯微鏡下隨機(jī)選取視野拍照，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下的細(xì)胞數(shù)。

1.7各組SKOV3細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白檢測(cè)采用Western blotting法。用10%、20%的hUC-MSCs培養(yǎng)液預(yù)處理SKOV3細(xì)胞24 h，分別計(jì)為觀察1組、觀察2組。以未經(jīng)hUC-MSCs培養(yǎng)液處理的SKOV3細(xì)胞為對(duì)照組。收集各組SKOV3細(xì)胞在RIPA緩沖液中裂解并收集蛋白，用12%SDS-PAGE電泳分離(最佳分離范圍12～60 kD)，隨后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入抗小鼠抗大鼠Bcl-2 mAb(1∶200)和Bax mAb(1∶200)以及內(nèi)參照GAPDH抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，用TBS/T洗3遍，加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶2 000)，室溫孵育1 h，用TBS/T洗3遍，最后加入ELC試劑，拍照分析。Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量以Bcl-2和Bax條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖活性比較①觀察1組、觀察2組、對(duì)照組吸光度值分別為0.50±0.09、0.80±0.06、0.21±0.04。觀察1、2組吸光度值均大于對(duì)照組(P均<0.05)，且觀察2組大于觀察1組(P<0.05)。②觀察1組、觀察2組、對(duì)照組細(xì)胞克隆數(shù)分別為(311.00±17.52)、(476.33±20.60)、(147.00±9.17)個(gè)，觀察1、2組細(xì)胞克隆數(shù)明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，且觀察2組高于觀察1組(P<0.05)。

2.2各組細(xì)胞凋亡率比較 觀察1組、觀察2組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為10.98%±1.28%、5.50%±0.67%、17.97%±1.50%。觀察1、2組細(xì)胞凋亡率低于對(duì)照組(P均<0.05)，且觀察2組低于觀察1組(P<0.05)。

2.3各組細(xì)胞遷移能力比較 ①觀察1組、觀察2組、對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合率分別為114.50%±19.09%、138.50%±0.71%、108.50%±14.85%。觀察1、2組細(xì)胞劃痕愈合率高于對(duì)照組(P均<0.05)，且觀察2組高于觀察1組(P<0.05)。②觀察1組、觀察2組、對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為155.00±151.50、335.67±344.50、151.33±145.50。觀察1、2組穿膜細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組(P均<0.05)，且觀察2組高于觀察1組(P<0.05)。

2.4各組細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)比較觀察1組、觀察2組、對(duì)照組細(xì)胞Bcl-2相對(duì)表達(dá)量分別為0.48±0.47、0.62±0.63、0.84±0.86，Bax相對(duì)表達(dá)量分別為0.75±0.78、0.64±0.63、0.58±0.56。觀察1、2組細(xì)胞Bcl-2相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P均<0.05)，且觀察2組高于觀察1組(P<0.05)；觀察1、2組細(xì)胞Bax相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P均<0.05)，且觀察2組低于觀察1組(P<0.05)。

3　討論

hUC-MSCs具有取材方便來(lái)源廣泛、免疫原性低、分泌多種細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是目前研究最多最深入的干細(xì)胞之一[7,8]，hUC-MSCs有望成為理想的細(xì)胞工程“種子細(xì)胞”。hUC-MSCs獲取的主要方法是貼壁法和酶消化法，但由于酶消化法操作步驟多，污染風(fēng)險(xiǎn)大以及對(duì)細(xì)胞有傷害。本研究通過(guò)臍帶組織貼壁法分離hUC-MSCs，傳代培養(yǎng)獲得純化的hUC-MSCs。

越來(lái)越多研究[9～11]表明腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。MSCs能夠受到炎癥因子的趨化遷移到炎癥組織處并對(duì)其進(jìn)行修復(fù)[12]，目前研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的微環(huán)境與炎癥周圍的微環(huán)境有許多相似之處，MSCs同樣能夠被招募到實(shí)質(zhì)腫瘤部位構(gòu)成其微環(huán)境，微環(huán)境中的MSCs能夠進(jìn)一步成為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，并參與腫瘤生長(zhǎng)、侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移和耐藥等過(guò)程。研究人員發(fā)現(xiàn),hUC-MSCs培養(yǎng)液對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移有促進(jìn)作用[13]，并推測(cè)這方面的作用可能是通過(guò)hUC-MSCs分泌的細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，觀察1、2組SKOV3細(xì)胞增殖和遷移能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率降低，且觀察2組比觀察1組顯著，提示hUC-MSCs通過(guò)旁分泌途徑促進(jìn)了SKOV3細(xì)胞的增殖和遷移并抑制其凋亡。McLean等[14]在分離腫瘤相關(guān)MSCs時(shí)發(fā)現(xiàn)有90%的原發(fā)性卵巢癌患者存在腫瘤相關(guān)MSCs，但是這些MSCs沒(méi)有致癌性，具有正常的核型和細(xì)胞表面標(biāo)記以及多向分化潛能增強(qiáng)。Chu等[15]發(fā)現(xiàn)從健康人網(wǎng)膜中分離的脂肪來(lái)源MSCs能夠明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。另外，So等[16]發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞與其微環(huán)境中的MSCs相互影響，MSCs通過(guò)分泌IL-6作用卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使卵巢癌細(xì)胞獲得間質(zhì)特性，此外還分泌基質(zhì)金屬蛋白酶增強(qiáng)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。不過(guò)也有研究發(fā)現(xiàn)MSCs能夠抑制卵巢癌的增殖遷移能力[17,18]，這些結(jié)果的不一致可能是由于MSCs來(lái)源不同以及所使用的卵巢癌細(xì)胞株不完全一致。

Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中重要成員，Bcl-2發(fā)揮促增殖和抑制下游凋亡途徑的激活作用，而B(niǎo)ax能夠與Bcl-2形成二聚體拮抗Bcl-2的促增殖作用，從而激活下游凋亡途徑。正常情況下，Bax和Bcl-2相互協(xié)調(diào)維持平衡，但如果受到體內(nèi)或是外部的刺激，將打破這個(gè)平衡導(dǎo)致機(jī)體功能紊亂。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，觀察1、2組SKOV3細(xì)胞Bcl-2表達(dá)升高，Bax表達(dá)下降，且觀察2組比觀察1組明顯，提示在hUC-MSCs細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，SKOV3細(xì)胞Bax的表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，這可能是與各組細(xì)胞細(xì)胞增殖、凋亡、遷移能力的變化有關(guān)。

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