高 玲 唐 紅

(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031)

線(xiàn)粒體功能受損是神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制之一，例如阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎縮側(cè)索硬化(AKS)〔1〕等。氧化應(yīng)激是伴有線(xiàn)粒體功能障礙的一個(gè)早期事件。在ATP的產(chǎn)生過(guò)程中，高能量的電子傳遞是一個(gè)必需步驟，但它同時(shí)也是活性氧(ROS)產(chǎn)生的來(lái)源〔2〕。ROS的積聚能損壞一些生物分子，包括脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和核酸，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性〔3〕。艾地苯醌是一種新型的腦代謝及精神癥狀改善劑，在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似輔酶Q10，具有良好的抗氧化活性〔4〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，艾地苯醌的抗氧化活性大約是輔酶Q10的100倍，而且還可以通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)。p53是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因子之一，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要的中介樞紐分子。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)下p53可以通過(guò)阻止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3是p53重要的下游基因。研究表明〔5〕，p53在AD動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中明顯升高，這與神經(jīng)元的凋亡有直接關(guān)系。艾地苯醌在許多神經(jīng)退行性疾病中表現(xiàn)出的神經(jīng)保護(hù)和治療作用是否通過(guò)降低p53蛋白表達(dá)而發(fā)揮對(duì)線(xiàn)粒體的保護(hù)作用還不清楚。本文探討艾地苯醌抑制氧化應(yīng)激所致皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1試劑與藥品 p53蛋白單克隆抗體、caspase3單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))、多聚賴(lài)氨酸、艾地苯醌(Sigma公司，美國(guó))，DMEM(Gibco公司，美國(guó))，胎牛血清及馬血清(Hyclone公司，美國(guó))，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1原代大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)〔6〕的方法略加改動(dòng)。取孕17～19 d的SD大鼠(來(lái)自吉林大學(xué)動(dòng)物部)的胎鼠，于無(wú)菌條件下取出大腦皮層去除血管和軟腦膜后剪碎成0.5 mm3，用D-Hank液洗2遍，置于0.25%胰蛋白酶中消化，37℃孵育15 min，加入10%胎牛血清終止胰酶消化，離心去上清。加入10%胎牛血清與5%馬血清的接種培養(yǎng)液，吸管吹打分散細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，尼龍網(wǎng)過(guò)濾，計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106細(xì)胞/ml接種于鋪有多聚賴(lài)氨酸的培養(yǎng)板內(nèi)，48 h后全量換液。72 h后將培養(yǎng)液中加入阿糖胞苷(10 μg/ml)以抑制非神經(jīng)細(xì)胞增殖。24 h后半量換液。以后每3 d半量換液1次，培養(yǎng)到7～10 d細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2神經(jīng)細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn) 取培養(yǎng)好的神經(jīng)細(xì)胞，每8孔為1組，過(guò)氧化氫(H2O2)共分5組，濃度分別為0.0、0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L；繪制量效關(guān)系曲線(xiàn)，選擇適當(dāng)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞生存力測(cè)定 采用MTT法進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)至所需天數(shù)時(shí)，經(jīng)H2O2等處理后的細(xì)胞(每組8孔)，每孔加入20 μl(5 mg/ml)MTT液，于37℃孵箱孵育4 h，取出，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，微量混勻器充分混勻，酶標(biāo)儀570 nm處讀取吸光度(A)值。

1.2.4LDH釋放率測(cè)定 用LDH釋放率來(lái)反映細(xì)胞損傷程度，按試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。實(shí)驗(yàn)中用不同濃度的艾地苯醌(1，5，10，20，50 μmol/L)預(yù)處理皮層神經(jīng)細(xì)胞2 h，然后分別加入0.5 mmol/L H2O2，6 h后測(cè)定細(xì)胞LDH釋放率。培養(yǎng)細(xì)胞每8孔為1組。

1.2.5Western印跡檢測(cè)p53蛋白、caspase3蛋白表達(dá) 細(xì)胞被裂解后，二甲基喹啉酸(BCA)法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。電泳時(shí)每個(gè)樣品上樣20 μg，蛋白質(zhì)經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用TBST溶液洗膜3次，封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，PVDF膜孵育在抗p53單克隆抗體(1∶1 000)，抗caspase3單克隆抗體(1∶1 000)中常溫下過(guò)夜，用TBST溶液反復(fù)清洗后在二抗溶液中室溫下孵育2 h，并在電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)系統(tǒng)中檢測(cè)目標(biāo)蛋白條帶。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用Prism軟件進(jìn)行雙因子方差分析。

2 結(jié) 果

2.1H2O2誘導(dǎo)的濃度和時(shí)間依賴(lài)性細(xì)胞死亡 0.1，0.3，0.5，0.7 mmol/L的H2O2作用于原代培養(yǎng)的鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞24 h后，細(xì)胞死亡率隨H2O2濃度增加而增大(各組細(xì)胞吸光度值分別為0.65±0.04、0.56±0.04、0.48±0.05、0.29±0.04)，0.5 mmol/L和0.7 mmol/L H2O2明顯降低細(xì)胞的生存率，與正常對(duì)照組(0.78±0.04)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明H2O2可引起濃度依賴(lài)性細(xì)胞死亡。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用0.5 mmol/L H2O2作用于培養(yǎng)3、6、24 h后的皮層神經(jīng)細(xì)胞，結(jié)果顯示隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞死亡率增加(各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞吸光度值分別為0.70±0.07，0.63±0.04，0.48±0.05)，作用于24 h后細(xì)胞的死亡率可達(dá)50%以上，說(shuō)明H2O2可引起時(shí)間依賴(lài)性細(xì)胞死亡。

2.2艾地苯醌抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 皮層神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)0.5 mmol/L H2O2培養(yǎng)6 h后，LDH釋放率可達(dá)85%以上〔(85.16±5.64)%〕，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(27.96±4.67)%,P<0.01〕，而提前應(yīng)用艾地苯醌2 h可以有效降低H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡〔1,5,10,20,50 μmol/L艾地苯醌組LDH釋放率分別(63.55±7.36)%、(55.98±6.25)%、(44.69±4.22)%、(67.64±4.57)%、(75.96±3.50)%〕，最后以10 μmol/L的艾地苯醌效果最明顯(P<0.01)，說(shuō)明艾地苯醌可以完全逆轉(zhuǎn)H2O2引起的細(xì)胞死亡。

2.3各組p53和caspase3蛋白表達(dá)水平 0.5 mmol/L H2O2處理6 h后升高的p53和caspase3蛋白水平可被艾地苯醌所抑制(圖1)，說(shuō)明艾地苯醌通過(guò)抑制p53蛋白的表達(dá)而降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率。

1～6：對(duì)照組、1，5，10，20，50 μmol/L艾地苯醌組圖1 各組p53和caspase3蛋白表達(dá)

3 討 論

1986年，日本的Takeda公司首先在臨床上應(yīng)用艾地苯醌治療與情緒紊亂相關(guān)的心血管病。在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元模型中，艾地苯醌可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽活性而使細(xì)胞不死來(lái)減弱氧化損傷。14C放射標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證明，口服艾地苯醌可通過(guò)血腦屏障。艾地苯醌可以保護(hù)由2-氨基-3羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷。艾地苯醌在許多不同的國(guó)家已作為臨時(shí)實(shí)驗(yàn)用藥或已被批準(zhǔn)用于臨床用藥。因它具有優(yōu)越的生物利用率和安全性，使它成為有吸引力的神經(jīng)退行性疾病治療藥物的候選。在臨床實(shí)驗(yàn)中，艾地苯醌提高AD患者記憶力和注意力并提高患者的行為能力，但不能減緩AD的認(rèn)知功能衰退〔7〕。而且艾地苯醌的劑量大于25 μmol/L時(shí)具有神經(jīng)毒性〔8，9〕。這一點(diǎn)也與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。p53蛋白被激活，從而啟動(dòng)程序細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究表明艾地苯醌預(yù)處理組可降低p53蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率，caspase3蛋白表達(dá)水平變化不明顯，說(shuō)明艾地苯醌的抗氧化應(yīng)激損傷是通過(guò)降低p53蛋白的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。

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