趙 明 易 虎

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，天津 300193)

草酸鈣結(jié)石是泌尿系結(jié)石的主要類型，占泌尿系結(jié)石的60%～80%〔1〕。在腎結(jié)石的形成過程中，腎上皮細胞(NRK)具有十分重要的作用〔2〕。研究顯示〔3〕，體外鈣刺激大鼠NRK細胞可誘導(dǎo)細胞骨橋蛋白(OPN)基因表達上調(diào)，OPN分泌增加。OPN可能參與了腎結(jié)石的形成過程，但其確切機制尚不清楚，且極少有體內(nèi)實驗報道。本研究通過小干擾RNA技術(shù)(siRNA)沉默OPN基因的表達，分析OPN在腎結(jié)石大鼠中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及細胞 雄性SD大鼠30只，體重160～180 g(天津?qū)嶒瀯游镏行奶峁?；293T細胞(上海復(fù)祥生物科技有限公司)。

1.2主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國sigma公司)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液5×(碧云天生物技術(shù)研究所)；腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeno-X(Clontech公司)；辣根酶標記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(Jakson分裝)；內(nèi)參抗體β-actin(北京康為世紀生物科技有限公司)；Western 一抗、二抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)研究所)；DAB 染色試劑盒(北京康為生物科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；其他試劑均為分析純國產(chǎn)試劑。

1.3主要儀器 超凈工作臺(AIRTECH，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)；BS223S型電子天平(北京賽多利斯儀器系列有限公司)；臺式低溫高速冷凍離心機(太倉市醫(yī)療械廠)；定量 PCR 儀(ABI step one plus，美國)；多功能酶標儀(DG-3022，美國)；GeneChip?Scanner (Affymetrix，美國)；NanoDrop超微量分光光度儀(Thermo Fisher Scientific，美國)；電泳儀(GE，美國)。

1.4方法

1.4.1重組RNA干擾腺病毒表達載體的構(gòu)建與包裝 參照文獻〔4〕方法，利用OligoEngine RNAi設(shè)計軟件，設(shè)計出針對OPN siRNA的特異性靶序列，siOPN上游引物5′-CGGTGAAAGTGGCTGAGTTT-3′，siOPN下游引物5′-TTTTCCCTTAGCCTTTATAGCAC-3′。siOPN上、下游引物重組入pSIREN-Shuttle，得到pSIREN-Shuttle-siOPN，經(jīng)酶切得到siRNA單元siOPN，分別重組入腺病毒載體pAdeno-X，得到pAdeno-X-siOPN，DNA測序證實。Pac I酶切重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-X-siOPN，用Lipofectamine2000將線性化的pAdeno-X-siOPN轉(zhuǎn)染至293T細胞，培養(yǎng)，收獲、純化重組病毒，測定滴度。

1.4.2高草酸尿大鼠模型的建立及分組 30只SD大鼠分為對照組、OPN siRNA組和空載組，每組10只。對照組用單蒸水和標準顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)，OPN siRNA組和空載組喂飼含1%氯化銨和0.8%乙二醇的飲水(加標準顆粒飼料)，喂飼9 d。

1.4.3腺病毒表達載體導(dǎo)入大鼠腎臟 建立模型后，飼養(yǎng)6 w，全身麻醉(腹腔注射10%水合氯醛)，連接動物呼吸機，氣管切開，打開胸腔，暴露腎臟，游離出左腎靜脈，使用小兒頭皮針穿刺腎靜脈。OPN siRNA組大鼠腎臟注射rAAV-asOPN 100μl(約6×107IU)，空載組注射等量空載體病毒顆粒。對照組不做處理。術(shù)畢，關(guān)閉胸腔，撤除呼吸機。清潔級環(huán)境、普通飼料飼養(yǎng)6 w后觀察各實驗指標。

1.5觀察指標

1.5.1RT-PCR檢測OPN基因轉(zhuǎn)錄 取出各組大鼠腎臟，Trizol法分別提取各組大鼠總RNA，目的基因引物序列：GADPH(305 bp)上游引物：5′-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′，下游引物：5′-GGTGGTGAAGAC GCCAGTAG-3′；OPN(245 bp)上游引物：5′-GGCACATTCCGGGACAGAGAGAA-3′，下游引物5′-CGGTTTACCCATGTGGTGCCTC-3′。 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用RT-PCR檢測OPN mRNA轉(zhuǎn)錄水平，以GADPH作為內(nèi)參照。

1.5.2Western印跡檢測OPN蛋白表達 取出各組大鼠腎臟，剪刀切碎，用預(yù)冷的組織裂解液提取大鼠腎臟總蛋白，Bradford法測定樣品的蛋白含量，12%凝膠分離蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)膜儀(濕轉(zhuǎn))在100 V、1.5 h的條件下將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后與OPN單克隆抗體(1∶1 000)過夜結(jié)合，ECL顯色，凝膠成像和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)收集顯色條帶，運用Quantity One軟件進行蛋白條帶數(shù)據(jù)分析。

1.5.3HE染色觀察草酸鈣晶體 參照文獻〔5〕方法，取腎后用預(yù)冷的PBS-草酸鈣溶液清洗腎臟組織，切腎組織成厚2～3 mm的小塊，再用預(yù)冷的PBS-草酸鈣溶液清洗。室溫下10%甲醛固定24 h。結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS-草酸鈣溶液清洗清洗3次，置入20%蔗糖溶液，4℃脫水72 h。再置入20%明膠，室溫下過夜，-80℃保存，制作10 μm冰凍切片。顯微鏡下觀察草酸鈣結(jié)晶形成情況。隨機選取6個視野，結(jié)晶程度計數(shù)用像素值(像素/視野)表示。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1OPN mRNA表達水平 OPN siRNA組OPN mRNA表達水平(0.25±0.08)顯著低于空載組(0.95±0.12，P<0.05)，顯著高于對照組(0.05±0.02，P<0.05)。

2.2OPN蛋白表達水平 OPN siRNA組OPN 蛋白表達水平(0.33±0.09)顯著低于空載組(0.96±0.15，P<0.05)，顯著高于對照組(0.08±0.02，P<0.05)。

2.3草酸鈣結(jié)石結(jié)石情況 OPN siRNA組大鼠腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)草酸鈣結(jié)石均顯著低于空載組(P<0.05)，顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)草酸鈣結(jié)石情況

與空載組比較：1)P<0.05；與對照組比較：2)P<0.05

3 討 論

我國泌尿系結(jié)石發(fā)病率為1%～10%，且呈逐年上升趨勢〔6〕。腎結(jié)石的常見成分為草酸鈣結(jié)石〔1〕。

OPN是一種多功能磷酸化糖蛋白，在骨骼、乳腺、腎臟、NK細胞及T 細胞等廣泛分布，具有多種功能。目前，OPN在結(jié)石形成過程中的作用還存在爭議。有學(xué)者認為OPN具有抑制草酸鈣結(jié)晶形成的作用；也有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)石形成早期階段OPN可能促進RNK細胞與草酸鈣結(jié)晶體的結(jié)合過程〔7〕。本文結(jié)果表明OPN siRNA病毒能有效抑制腎組織OPN的表達水平。

在細胞水平已有大量研究證明了OPN在草酸鈣結(jié)晶形成過程中的重要作用。席啟林等〔4〕采用鈣離子干預(yù)大鼠腎上皮細胞，結(jié)果顯示鈣離子刺激后NRKOPN表達水平上升，通過構(gòu)建有效沉默OPN基因表達的慢病毒載體并導(dǎo)入大鼠NRK細胞，可顯著降低OPN表達水平和一水草酸鈣含量。歐善際〔8〕報道，大鼠腎小管上皮細胞受一水草酸鈣刺激后OPN 表達水平上升，但高濃度一水草酸鈣使OPN表達水平降低，認為高濃度一水草酸鈣通過損傷腎小管上皮細胞導(dǎo)致OPN表達水平降低，進而促進形成結(jié)石。Yamate等〔9〕也證實在腎結(jié)石形成的早期階段，OPN具有促進草酸鈣結(jié)晶在細胞上沉積和黏附的作用，通過沉默OPN可抑制草酸鈣晶體的沉積。因此，結(jié)石形成早期階段，OPN可能促進了NRK與草酸鈣結(jié)晶體的結(jié)合過程。

本研究表明，抑制大鼠腎組織OPN表達可降低草酸鈣晶體在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)的沉積，OPN具有促進草酸鈣腎結(jié)石形成的作用，與文獻報道一致〔6〕。目前多數(shù)研究認為由集合管、遠曲小管和髓袢等分泌的OPN可抑制尿路結(jié)石形成，主要表現(xiàn)在抑制草酸鈣結(jié)晶的黏附力和成核；同時，尿液中的OPN可促進一水草酸鈣向黏附力較低的二水草酸鈣轉(zhuǎn)化，促進二水草酸鈣的排泄〔10〕。

1Mohamaden W，Wang H，Guan H，etal.Immunohistochemical localization and mRNA quantification of osteopontin and Tamm-Horsfall protein in canine renal tissue after potassium oxalate injection〔J〕.BMC Vet Res，2014；10(1)：70.

2王 立，李 磊，李 博.雌二醇對草酸鈣結(jié)石造模大鼠腎小管細胞骨橋蛋白表達的影響〔J〕.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2012；14(s2)：619-20.

3姚秀瓊，鄧穗平，歐陽健明.HKC細胞損傷對草酸鈣晶體成核和聚集的促進作用〔J〕.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2011；32(2)：236-40.

4席啟林，劉 喆，侯建全，等.骨橋蛋白在高鈣促進大鼠腎上皮細胞與草酸鈣晶體黏附中的作用〔J〕.中華實驗外科雜志，2014；31(8)：1762-5.

5馬 超，席啟林，侯建全，等.沉默高草酸尿大鼠腎臟骨橋蛋白基因的表達對草酸鈣晶體在腎臟中沉積的影響〔J〕.中華實驗外科雜志，2016；33(12)：2675-7.

6徐 剛，夏 維，鄒曉峰，等.腎特發(fā)性草酸鈣結(jié)石形成與骨橋蛋白的關(guān)系〔J〕.中華實驗外科雜志，2015；32(6)：1252-5.

7甘瓊枝，孫新園，姚秀瓊，等.腎上皮細胞損傷使草酸鈣晶體黏附增強的分子機制〔J〕.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報，2016；37(6)：1050-8.

8歐善際.草酸鈣晶體對大鼠腎小管上皮細胞骨橋蛋白表達的影響〔D〕.長春：吉林大學(xué)，2011.

9Yamate T，Kohri K，Umekawa T，etal.Osteopontin antisense oligonucleotide inhibits adhesion of calcium oxalate crystals in Madin-Darby canine kidney cell〔J〕.J Urol，1998；160(4)：1506-12.

10夏 維.骨橋蛋白與特發(fā)性草酸鈣結(jié)石的相關(guān)性研究〔D〕.南昌：南昌大學(xué)，2014.