魯黎明，曾孝敏，顧會(huì)戰(zhàn)，張啟莉，喻 曉，王 棟，何佶弦，李立芹，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川省煙草公司 廣元市公司，四川 廣元 628017)

碳氮代謝是煙草的基礎(chǔ)代謝，不僅影響煙草的正常生長(zhǎng)發(fā)育，而且影響與煙草品質(zhì)相關(guān)的各類化合物的合成與轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)形成[1]。其中，氮代謝包括無機(jī)氮(硝態(tài)氮)的還原、同化，以及有機(jī)含氮化合物的轉(zhuǎn)化、合成等過程。煙葉中氮代謝強(qiáng)度與施氮量水平關(guān)系密切。岳紅賓[2]與許晨曦等[3]的研究結(jié)果均顯示，隨著氮素水平提高，葉片中硝酸還原酶(NR)的活性有上升趨勢(shì)，供氮較低時(shí)，煙葉由氮代謝向碳代謝轉(zhuǎn)化的時(shí)間提前，反之則推后。李洪臣等[4]的研究表明，增加施氮量與追氮比例，可以增強(qiáng)煙株的氮代謝強(qiáng)度，改善其光合性能。在煙草氮代謝關(guān)鍵基因響應(yīng)外界氮素誘導(dǎo)研究方面，王紅麗等[5]研究發(fā)現(xiàn)，NR基因的表達(dá)量在不同供氮水平間并無明顯差異，而谷氨酰胺合成酶(GS)基因的表達(dá)量，在煙葉進(jìn)入成熟期前隨施氮量的增加而增強(qiáng)，在成熟期后則表現(xiàn)相反。劉維智[6]研究了缺氮處理對(duì)亞硝酸還原酶及硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(NRT)基因表達(dá)的影響，缺氮可以顯著誘導(dǎo)這2個(gè)基因的表達(dá)，暗示其在煙草氮代謝中發(fā)揮著重要作用。烤煙氮代謝產(chǎn)物含量與氮素供應(yīng)量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系[6]。研究表明，在一定范圍內(nèi)，隨著施氮量增加，烤煙中的總氮、煙堿、蛋白質(zhì)和氨基酸含量均有不同程度的增加[6，7-10]。在烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過程中，煙葉總氮的相對(duì)含量不斷降低，但當(dāng)供氮量增加時(shí)，下降幅度明顯減慢，煙堿含量顯著增加[11]。

目前，有關(guān)氮素供應(yīng)水平對(duì)煙草氮代謝關(guān)鍵酶活性影響的研究較多，但是，對(duì)關(guān)鍵酶基因表達(dá)影響的研究較少，而且還缺乏施氮水平、基因表達(dá)及氮代謝產(chǎn)物的相關(guān)關(guān)系研究。本研究通過田間試驗(yàn)，分析不同施氮量對(duì)烤煙氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)及含氮化合物含量的影響，以期為煙草氮代謝的理論研究及其調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試烤煙品種為云煙87和K326。供試肥料包括煙草專用復(fù)合肥(N-P2O5-K2O，10%-15%-25%，四川金葉化肥有限公司)、磷酸一銨(N-P2O5-K2O，10%-44%-0，四川龍蟒集團(tuán))、硫酸鉀(K2O 50%，四川川化青上化工有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016年在四川省廣元市劍閣縣普安鎮(zhèn)劍坪村廣元市煙草公司科研基地進(jìn)行。采用二因素裂區(qū)設(shè)計(jì)，以氮肥施用量為主區(qū)因素(A)，品種為副區(qū)因素(B)，共6個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。氮肥施用量：90 kg·hm-2(A1)、105 kg·hm-2(A2)、120 kg·hm-2(A3)；品種：云煙87(B1)和K326(B2)。每小區(qū)栽煙60株，行距1.1 m，株距0.5 m。試驗(yàn)地磷、鉀肥施用量分別為P2O5157.5 kg·hm-2、K2O 210 kg·hm-2。

1.3 試驗(yàn)方法

2016年1月按常規(guī)漂浮育苗法育苗，5月1日移栽。肥料分基肥、追肥施用(基追比7∶3)，5月16日及5月30日各追肥一次。田間管理按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉管理規(guī)程進(jìn)行。分別于移栽后45、60、80 d分小區(qū)采集鮮煙葉樣品。

鮮煙葉的采集。每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)選擇30株長(zhǎng)勢(shì)基本一致的煙株掛牌，每次采摘中部葉(第10葉位)。將采摘的中部葉迅速沿主脈分開：一半鮮樣立即用液氮冷凍，保存于-80 ℃冰箱，用于相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)；另一半鮮樣先在105 ℃殺青，再粉碎保存，用于測(cè)定煙葉中的煙堿、總氮及可溶性蛋白質(zhì)含量。

煙堿及總氮含量的測(cè)定，參照王瑞新[12]的方法進(jìn)行?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量的測(cè)定，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[13]。

1.4 基因表達(dá)量分析

采用Trizol法[14]提取樣品總RNA。按照Fermentas公司RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒的操作說明合成cDNA第一條鏈。

參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中NR、GS、谷氨酸合成酶(GOGAT)的基因cds序列設(shè)計(jì)引物(表1)。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，加入相應(yīng)引物及其他反應(yīng)試劑，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(10 μL)：2×Premix SYBR Max 5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 2 μL。反應(yīng)條件：50 ℃孵育2 min，95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 sec，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因相對(duì)表達(dá)量

2.1.1 NR

NR是植物氮代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，也是氮代謝強(qiáng)弱的關(guān)鍵衡量指標(biāo)[15]。在本研究中，NR基因表達(dá)量在45～80 d間總體表現(xiàn)為先降低后升高，并在栽后80 d達(dá)到最高(圖1)。由此可見，在本研究施氮量水平下，NR的轉(zhuǎn)錄在煙株生長(zhǎng)后期仍然維持在一個(gè)較高的水平，以利于氮素同化。在成熟期(80 d)，同一施氮水平上不同品種間NR的表達(dá)水平存在顯著(P<0.05)差異，說明其氮素響應(yīng)機(jī)制并不相同。

表1qRT-PCR所用引物序列

Table1Primers for qRT-PCR

引物Primer序列Sequences(5′→3′)EF?1a(tobacco)?FTGAGATGCACCACGAAGCTCEF?1a(tobacco)?RCCAACATTGTCACCAGGAAGTGNR?FTCAGAAGCCATTTTGAGAGAACATNR?RAATCATAGGAGGTGGTCCACAAGGS?FCACGAAACAGCCAACATCAGGS?RCCGTCCTTCTGTCCTCAAAAGOGAT?FGCTCCGGTGGGTCAAATGGOGAT?RCTTTCGTGCTGCCCGTTT

2.1.2 GS

GS催化谷氨酰胺的合成，是高等植物銨離子同化的主要途徑[16]。本研究中，各處理GS基因的相對(duì)表達(dá)量總體呈現(xiàn)出隨生育進(jìn)程而上升的趨勢(shì)，且前期上升較快，后期上升較慢(圖2)，說明煙株后期銨離子同化仍然維持在較高水平。

2.1.3 GOGAT

2.2 含氮化合物含量

2.2.1 煙堿

煙堿是煙草所特有的生物堿，也是一類含氮的次生代謝產(chǎn)物[17]。總體而言，各處理的煙堿含量隨著生育進(jìn)程呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。如表2所示：栽后45、60 d，各處理煙堿含量差異不顯著；但在移栽后80 d，低氮(A1)水平下兩品種煙葉的煙堿含量表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。

相同移栽天數(shù)不同處理上無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。Treatments marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05 during the same growth period. The same as below.圖1 各處理不同時(shí)期硝酸還原酶的基因相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Comparison of relative expression levels of nitrate reductase (NR) gene among different treatments at different stages

圖2 各處理不同時(shí)期谷氨酰胺合成酶基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Comparison of relative expression levels of glutamine synthetase (GS) gene among different treatments at different stages

圖3 各處理不同時(shí)期谷氨酸合成酶基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Comparison of relative expression levels of glutamate synthase (GOGAT) gene among different treatments at different stages

表2各處理不同時(shí)期煙葉煙堿含量

Table2Nicotine content in tobacco leaf under different treatments at different stages %

同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Data marked without the same letters in the same column indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

2.2.2 總氮

總氮是煙葉內(nèi)含氮化合物的總和，與外界環(huán)境中的氮素供應(yīng)密切相關(guān)。從表3可以看出，在相同生育期，各處理總氮含量無顯著差異。隨著煙草生育期進(jìn)程，各處理煙葉的總氮含量表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。這一方面是因?yàn)闊熑~成熟期碳代謝較強(qiáng)；另一方面，成熟期也是煙葉衰老的過程，含氮化合物的降解較多，導(dǎo)致總氮含量降低。

2.2.3 可溶性蛋白

植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)，大多是參與各種代謝的酶類，其含量是衡量植物體總代謝強(qiáng)度的一項(xiàng)重要生理生化指標(biāo)[18]。在煙草整個(gè)生育期中，可溶性蛋白的含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)(表4)，以栽后60 d含量最高，說明打頂期是煙株各類代謝活動(dòng)最旺盛的階段。栽后45 d，低氮(A1)水平煙株可溶性蛋白含量顯著(P<0.05)低于其他供氮水平。栽后80 d，云煙87(B1)的可溶性蛋白含量隨供氮水平增加而顯著(P<0.05)上升，而K326(B2)的可溶性蛋白含量在各供氮水平下無顯著差異。

表3各處理不同時(shí)期煙葉總氮含量

Table3Content of total nitrogen in tobacco leaf under different treatments at different stages %

2.3 氮代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量與含氮化合物含量的相關(guān)分析

表4各處理不同時(shí)期煙葉可溶性蛋白含量

Table4Content of soluble protein in tobacco leaf under different treatments at different stages %

由表5可見，栽后45 d，NR基因的表達(dá)量與煙堿含量呈顯著(P<0.05)負(fù)相關(guān)，與可溶性蛋白含量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)。栽后60 d，GS基因的表達(dá)量與煙堿含量呈顯著(P<0.05)負(fù)相關(guān)。栽后80 d，3個(gè)氮代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量與3個(gè)含氮化合物之間無顯著相關(guān)性。

表5各時(shí)期氮代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量與含氮化合物含量的相關(guān)性

Table5Correlation between gene expression in nitrogen metabolism and nitrogenous compounds at different stages

栽后天數(shù)Daysafterplanting/d基因Gene含氮化合物Nitrogenouscompounds煙堿Nicotine總氮Totalnitrogen可溶性蛋白Solubleprotein45GOGAT030402640028GS-0567-00920216NR-0835?06970964??60GOGAT-04730440016GS-0901?0388045NR0058-0162-032380GOGAT-015-02240211GS027-03540541NR0689-07530716

*與**分別表示顯著(P<0.05)與極顯著(P<0.01)相關(guān)。

* and ** represented significant correlation atP<0.05 andP<0.01， respectively.

3 討論

氮素對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)量形成至關(guān)重要[19-20]。對(duì)煙草而言，氮素不僅影響到碳氮代謝的水平與糖、氮、煙堿等物質(zhì)的積累，也會(huì)影響碳氮代謝轉(zhuǎn)化的時(shí)間與速度[17]。在煙葉生產(chǎn)中，氮素通過影響煙草的碳氮代謝來影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，氮素過多或過少時(shí)，均會(huì)導(dǎo)致煙葉產(chǎn)量下降，化學(xué)成分不協(xié)調(diào)，品質(zhì)變差[21-22]。

NR是氮代謝途徑的關(guān)鍵酶與限速酶，也是煙草氮同化的最初反應(yīng)催化者[5]。連文力[23]研究表明，在煙葉成熟期，NR基因表達(dá)維持在較高水平，并且施氮量低的處理的NR基因表達(dá)量顯著高于施氮量高的處理。本研究也顯示，在煙葉成熟期，NR基因的表達(dá)量維持在高水平，而且中等施氮水平下NR基因表達(dá)量要高于其他供氮水平。NR在煙葉生長(zhǎng)后期仍維持在較高水平，表明煙株進(jìn)入成熟期后仍然具有較高的氮同化能力，以維持煙株的基礎(chǔ)氮代謝。

氮代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平與煙葉中含氮化合物的含量密切相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在煙葉大田生長(zhǎng)前期，NR基因的表達(dá)量與煙葉中可溶性蛋白含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，說明此時(shí)煙葉氮同化的產(chǎn)物大多為參與基礎(chǔ)代謝的酶類，煙葉進(jìn)行著旺盛的生長(zhǎng)。而前、中期煙堿的含量則與煙葉NR、GS的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。煙葉的氮代謝是一個(gè)非常復(fù)雜的生化過程，受多種因素的影響。深入分析其中的分子機(jī)制，對(duì)于調(diào)控?zé)熑~中煙堿的含量、提高煙葉的品質(zhì)，具有十分重要的意義。

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