楊萬風(fēng)，劉 艷，陸辰晨，邵沛澤，諶運清，趙文軍

(1.連云港出入境檢驗檢疫局，江蘇 連云港 222042； 2.連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222001； 3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100029)

菊基腐病菌[1](Erwiniachrysanthemi)和洋蔥腐爛病菌[2-3](Burkholderiagladiolipv.alliicola)是引起郁金香軟腐病的重要細菌。這2種病原菌因其在國外發(fā)生分布廣、定殖風(fēng)險高、經(jīng)濟危害大，已被中國出入境機構(gòu)列為進境植物檢疫性有害生物。近年來，國內(nèi)花卉消費快速增長，我國進口郁金香種球呈逐年增長態(tài)勢。國外郁金香主產(chǎn)國多數(shù)是這2種病菌的疫區(qū)，因此這2種病菌隨進口郁金香種球傳入我國的風(fēng)險較大。目前，國內(nèi)種苗指定口岸對細菌的檢測多數(shù)仍采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定方法，鑒定時間較長，影響快速通關(guān)。因而，建立快速實用、準(zhǔn)確靈敏、操作簡便的分子檢測技術(shù)對控制病菌的傳入具有重要意義。

目前，對這2種細菌的分子檢測技術(shù)已有不少報道。國內(nèi)外不少學(xué)者已初步建立了洋蔥腐爛病菌的常規(guī)PCR檢測方法[2-4]。Lee等[5]運用RFLP和PFGE方法分析了臺灣的菊基腐病菌；劉鵬等[6]設(shè)計了專化性引物，鑒定了菊基腐病菌。但是上述研究均只檢測1種細菌，同步檢測上述2種細菌的分子檢測方法還未見報道。雙重PCR技術(shù)可在1次反應(yīng)中同時檢測2種病菌，大幅節(jié)約檢測時間，提高檢測效率，降低檢測成本。目前，該技術(shù)在植物病原物的檢測應(yīng)用中比較廣泛[7-10]。

本研究根據(jù)洋蔥腐爛病菌核糖體基因ITS序列設(shè)計特異性引物，與已發(fā)表的菊基腐病菌的?；砸锝M合成雙重PCR體系，對洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌進行同步檢測，以期提高種苗指定口岸檢疫性細菌疫情檢出率。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的洋蔥腐爛病菌、菊基腐病菌及其相關(guān)細菌菌株見表1。

1.2 試劑、耗材及儀器

2×TaqMaster Mix和細菌基因組提取試劑盒購自上海捷瑞生物公司，DNA Marker購自大連寶生物公司。研究所用儀器包括PCR儀(ABI)、分光光度計(Biochrom)、高速離心機(Eppendorf)、凝膠成像系統(tǒng)(UVP)等。

1.3 引物序列

根據(jù)GenBank上發(fā)表的洋蔥腐爛病菌核糖體基因ITS序列保守區(qū)域(GenBank登錄號為KU507041.1)，通過比較同屬其他細菌的保守序列和差異區(qū)域，運用Primer premier5.0軟件設(shè)計1對引物B3/B6，擴增片段長度為208 bp，引物由南京思普金生物科技有限公司合成，序列見表2。

1.4 引物B3/B6的PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系為25 μL∶2×TaqMaster Mix 12.5 μL，引物B3/B6 (20 μmol·L-1)各0.25 μL，模板0.5 μL，補足雙蒸水至25 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物電泳檢測后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照。

1.5 引物B3/B6特異性檢測

將參試的細菌菌株培養(yǎng)到對數(shù)期，利用試劑盒提取基因組，以引物B3/B6分別擴增各參試菌株，無菌水作陰性對照，PCR反應(yīng)條件同1.4節(jié)。試驗重復(fù)3次。

1.6 引物B3/B6靈敏度檢測

將洋蔥腐爛病菌NCPPB 948振蕩培養(yǎng)后提取基因組，利用分光光度計測定基因組濃度，然后以無菌水對基因組進行10倍梯度稀釋，以稀釋后的梯度濃度基因組作為模板進行PCR反應(yīng)，并分析其靈敏度。試驗重復(fù)3次。

1.7 雙重PCR檢測

1.7.1 雙重PCR反應(yīng)體系的建立

利用設(shè)計的洋蔥腐爛病菌特異性引物B3/B6同文獻[1]公布的菊基腐病菌特異性引物ADE1/ADE2結(jié)合，建立雙重PCR體系。ADE1/ADE2的序列見表2，該引物可對菊基腐病菌特異性擴增出1條420 bp的條帶。

雙重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：以2種病菌的基因組DNA為模板，設(shè)計60～67 ℃ 8種不同的退火溫度(梯度1 ℃)、0.1～0.5 μL 5種不同梯度的引物量(20 μmol·L-1)、25～40次4種不同循環(huán)次數(shù)(梯度5次)進行擴增。

雙重PCR反應(yīng)體系為25 μL∶2×TaqMaster Mix 12.5 μL，2對引物(20 μmol·L-1) 0.3 μL，模板0.5 μL，補足雙蒸水至25 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，66 ℃退火20 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物電泳檢測后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照。實驗重復(fù)3次。

1.7.2 雙重PCR特異性檢測

表1供試菌株

Table1Bacterial strains tested

編號No．菌株Strain菌株代號NamePCR產(chǎn)物PCRproducts引物B3/B6PrimerB3/B6引物B3/B6和ADE1/ADE2PrimerB3/B6andADE1/ADE21Burkholderiagladiolipv．a(chǎn)lliicolaNCPPB948++2B．gladiolipv．a(chǎn)lliicolaLMG2121++3B．gladiolipv．a(chǎn)lliicolaLMG6915++4ErwiniachrysanthemiICMP10850-+5E．chrysanthemiNCPPB2309-+6E．chrysanthemiATCC11662-+7B．gladiolipv．gladioliLMG2216--8B．gladiolipv．a(chǎn)garicicolaNCPPB3580--9B．caryophylliICMP512--10B．a(chǎn)ndropogonisLMG2129--11B．cepaciaLMG1222--12B．glumaeATCC33617--13B．plantariiDSM9510--14B．a(chǎn)mbifariaNCPPB4421--15B．multivoransNCPPB4234--16B．phenaziniumLMG2247--17B．stabilisNCPPB4238--18E．carotovorasubsp．carotovoraECC--19CurtobacteriumpusillumNCPPB4113--20C．flaccumfacienspv．oortiiATCC25283--21C．flaccumfacienspv．flaccumfaciensLMG5473--22Pseudomonassyringaepv．syringaePSS--23P．syringaepv．glycineaATCC8727--24RalstoniasolanacearumRS--25Clavibactermichiganensissubsp．michiganensisATCC14456--26EscherichiacoliBL21--27Xanthomonasaxonopodispv．vignicolaATCC11648--28X．campestrispv．campestrisXCC--29X．oryzaepv．oryzaePXO99--30X．oryzaepv．oryzicolaRSGD42--31X．fragariaeXF--32Leucobactersp．P6--33Kocuriasp．P7--34Enterococcussp．P8--

+， 檢測到PCR產(chǎn)物；-，未檢測到PCR產(chǎn)物。

+， expected PCR products; -， no expected PCR products.

表2引物序列

Table2Nucleotide sequences of primers used in this study

引物Primer引物序列(5′?3′)Sequences產(chǎn)物大小PCRproduct/bp來源SourceB3TGGCGGTAGAAACCTGAGAG208GenBankaccessionNo．KU5070411B6ACGACAGCCGATAAGCACACTADE1GATCAGAAAGCCCGCAGCCAGAT420Reference[1]ADE2CTGTGGCCGATCAGGATGGTTTTGTCGTGC

以供試菌株的基因組DNA為模板，利用已建立的雙重PCR反應(yīng)體系，檢測雙重PCR反應(yīng)體系的特異性。同時以洋蔥腐爛病菌NCPPB 948和菊基腐病菌ICMP 10850的混合DNA為模板，進行雙重PCR檢測。產(chǎn)物電泳檢測后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照。

1.7.3 雙重PCR靈敏性檢測

利用試劑盒提取洋蔥腐爛病菌NCPPB 948和菊基腐病菌ICMP 10850基因組DNA，并以分光光度計測其濃度，分別用無菌水調(diào)整其至1.0×102ng·μL-1，以混合DNA作模板，檢測雙重PCR的靈敏度。產(chǎn)物電泳檢測后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照。

1.8 帶菌樣品的檢測

將洋蔥腐爛病菌NCPPB 948和菊基腐病菌ICMP 10850在培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h后用無菌水制成1.0×108cfu·mL-1的菌懸液，用接種針直接蘸取菌懸液后刺穿郁金香種苗葉片進行接種。1～3 d后收集發(fā)病區(qū)域的葉面。用試劑盒提取植物全基因組DNA后進行雙重PCR反應(yīng)，以接種無菌水的葉片DNA作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物B3/B6常規(guī)PCR特異性檢測

用試劑盒分別提取洋蔥腐爛病菌和其他參試菌株的基因組DNA，進行常規(guī)PCR擴增反應(yīng)，以驗證設(shè)計的引物B3/B6的特異性。結(jié)果顯示，只有3株洋蔥腐爛病菌擴增出了208 bp的預(yù)期產(chǎn)物，而其他參試菌株均未擴增出相應(yīng)的條帶(表1)。

2.2 引物B3/B6常規(guī)PCR靈敏度檢測

提取洋蔥腐爛病菌NCPPB 948的DNA，分光光度計測出其濃度為1.684×102ng·μL-1，將其10倍等比梯度稀釋后進行常規(guī)PCR。結(jié)果顯示，隨著DNA模板濃度的遞減，PCR產(chǎn)物量明顯減少。當(dāng)DNA稀釋到1.684×10-2ng·μL-1時，無法檢測到擴增產(chǎn)物(圖1)。

M， DNA marker (DL2000); 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7：分別表示DNA 濃度為： 1.684×102， 1.684×101， 1.684×100， 1.684×10-1， 1.684×10-2， 1.684×10-3， 1.684×10-4 ng·μL-1.M， DNA marker(DL2000); 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7: DNA concentrations 1.684×102， 1.684×101， 1.684×100， 1.684×10-1， 1.684×10-2， 1.684×10-3， 1.684×10-4 ng·μL-1， respectively.圖1 引物B3/B6靈敏度檢測結(jié)果Fig.1 Sensitivity of PCR for primers B3/B6 to detect serially diluted genomic DNA

2.3 雙重PCR反應(yīng)體系的建立

設(shè)計不同的退火溫度、引物量、循環(huán)次數(shù)，對雙重PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，綜合考慮檢測時間、非特異性條帶和引物二聚體、檢測成本，經(jīng)過篩選，退火溫度為66 ℃、循環(huán)次數(shù)30次，引物各0.3 μL時為最佳反應(yīng)體系。

2.4 雙重PCR特異性檢測結(jié)果

應(yīng)用雙重PCR反應(yīng)體系，以洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌的混合DNA作為模板，能同時觀察到208 bp 和420 bp的2條目的條帶(結(jié)果未顯示)，并且無非特異性條帶和引物二聚體形成；利用雙重PCR反應(yīng)體系擴增表1中各參試菌株時，3株洋蔥腐爛病菌產(chǎn)生208 bp的目的條帶，3株菊基腐病菌產(chǎn)生420 bp的目的條帶，其余參試菌株未擴增出特異性條帶。

2.5 雙重PCR靈敏度檢測結(jié)果

PCR擴增濃度為1.0×102ng·μL-1病菌混合DNA的10倍梯度稀釋模板，驗證雙重PCR體系的靈敏度。結(jié)果表明，當(dāng)DNA濃度達到1.0×10-1ng·μL-1時仍可檢測到信號(圖2)。

2.6 帶菌樣品的檢測結(jié)果

用菌液人工接種郁金香葉片，提取發(fā)病組織的總DNA后進行雙重PCR檢測，結(jié)果表明，運用該方法可同時檢測到2種病原菌，產(chǎn)生2種病原菌目的條帶；而健康組織的陰性對照則未擴增到相應(yīng)的信號(圖3)。

M, DNA marker (DL2000); 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7, 依次表示DNA 濃度為 1.0×102， 1.0×101， 1.0×100， 1.0×10-1， 1.0×10-2， 1.0×10-3， 1.0×10-4 ng·μL-1。M, DNA marker(DL2000); 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7, DNA concentrations 1.0×102， 1.0×101， 1.0×100， 1.0×10-1， 1.0×10-2， 1.0×10-3， 1.0×10-4 ng·μL-1， respectively.圖2 雙重PCR靈敏度檢測結(jié)果Fig.2 Sensitivity of duplex PCR to detect serially diluted genomic DNA

M， DNA marker (DL2000); 1， Burkholderia gladioli pv. alliicola; 2， Erwinia chrysanthemi; 3， Burkholderia gladioli pv. Alliicola， Erwinia chrysanthemi; 4， 對照。M， DNA marker (DL2000); 1， Burkholderia gladioli pv. alliicola; 2， Erwinia chrysanthemi; 3， Burkholderia gladioli pv. Alliicola， Erwinia chrysanthemi; 4， The control.圖3 人工接種樣品雙重PCR檢測結(jié)果Fig.3 DNA analysis of the seed infected artificially with duplex PCR assay

3 結(jié)論與討論

改革開放以來，我國花卉產(chǎn)業(yè)取得了舉世矚目的成就，郁金香花卉產(chǎn)業(yè)已成為我國部分農(nóng)村經(jīng)濟和農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)型升級的新增長點[11]。我國種植的郁金香多數(shù)是進口品種，洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌隨進口郁金香種球傳入存在一定的風(fēng)險。我國歷年檢疫截獲的數(shù)據(jù)顯示，我國曾從大花惠蘭、石斛蘭、甜玉米種子中截獲過洋蔥腐爛病菌，從風(fēng)信子和蝴蝶蘭中截獲過菊基腐病菌[12]，但在進口郁金香種球中還未有截獲的報道。洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌主要靠帶菌種球作遠距離傳播，在儲藏期間它們經(jīng)常復(fù)合侵染，引起種球軟腐，造成重大經(jīng)濟損失。如只用普通PCR技術(shù)分別對這2種細菌進行檢測，工作量偏大，費時費力，與口岸貨物快速通關(guān)要求不符。另外，進口種球類貨物對時間要求較為嚴(yán)格，如在口岸存儲時間過長易導(dǎo)致發(fā)芽變質(zhì)，使貨物失去使用價值，因而建立同時檢測這2種危險性細菌的分子檢測技術(shù)十分重要。

本研究設(shè)計了洋蔥腐爛病菌特異性引物，在考慮到引物退火溫度不同和引物間相互干擾等因素的基礎(chǔ)上，結(jié)合已公布的菊基腐病菌的特異性引物，建立雙重PCR體系，并對該體系的反應(yīng)條件進行優(yōu)化。該檢測體系可有效地檢測參試的洋蔥腐爛病菌、菊基腐病菌及模擬帶菌葉片，具有較強的特異性，靈敏度也較高。應(yīng)用該雙重PCR能夠一次檢測出洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌，大幅節(jié)約實驗室時間和檢測成本。本研究建立的雙重PCR方法可滿足口岸實際的檢測需求。郁金香種球進口量較大，在國外也必須經(jīng)過儲藏、整理、加工、運輸?shù)仁侄?，時間跨度較長，種球上潛伏的洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌可能會在倉庫內(nèi)發(fā)生和擴展。本研究立足口岸檢測一線實際，建立了快速靈敏的雙重PCR檢測方法，應(yīng)用該方法可成功檢測到洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌的針刺帶菌樣品。使用本研究建立的方法，對進境種球樣品進行同步檢測，檢測有陽性的樣品再進行針對性梯度分離，如為陰性則無需進行分離及種植試驗。使用本研究建立的雙重PCR檢測方法，將大大提高各種苗指定口岸的檢疫水平和工作效率，大幅減輕實驗室的鑒定工作量，分離成功的可能性增大，為阻止洋蔥腐爛病菌和菊基腐病菌的傳入，提高口岸檢出率和通關(guān)效率有較大幫助。

[1] NASSAR A， DARRASSE A， LEMATTRE M， et al. Characterization ofErwiniachrysanthemiby pectinolytic isozyme polymorphism and restriction fragment length polymorphism analysis of PCR-amplified fragments ofpelgenes[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology， 1996， 62(7):2228-2235.

[2] BAUERNFEIND A， SCHNEIDER I， JUNGWIRTH R， et al. Discrimination ofBurkholderiagladiolifrom otherBurkholderiaspecies detectable in cystic fibrosis patients by PCR[J].JournalofClinicalMicrobiology， 1998，36(9):2748-2751.

[3] MAEDA Y， SHINOHARA H， KIBA A， et al. Phylogenetic study and multiplex PCR based detection ofBurkholderiaplantarii，BurkholderiagumoandBurkholderiagladioliusinggyrBandrpoDsequences[J].IntemationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology， 2006，56(5): 1031-1038.

[4] WHITBY P W， POPE L C， CARTER K B， et al.Species-specific PCR as a tool for the identification ofBurkholderiagladioli[J].JournalofClinicalMicrobiology， 2000， 38(1):282-285.

[5] LEE Y A， CHEN K P， HSU Y W. Characterization ofErwiniachrysanthemi， the soft-rot pathogen of white-flowered calla lily， based on pathogenicity and PCR-RFLP and PFGE analyses[J].PlantPathology， 2006， 55(4):530-536.

[6] 劉鵬，黃國明，劉勇，等.菊歐文氏菌分子檢測技術(shù)的研究[J].植物病理學(xué)報，2007，37(6):34-37.

LIU P， HUANG G M， LIU Y， et al. Molecular detection ofErwiniachrysanthemi[J].ActaPhytopathologicaSinica， 2007，37(6):34-37. (in Chinese with English abstract)

[7] 楊萬風(fēng)，劉艷，劉翔，等. 雙重PCR法同步檢測菜豆暈疫病菌和萎蔫病菌[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2015， 27(9):1612-1618.

YANG W F， LIU Y， LIU X， et al. Duplex PCR detection ofPseudomonassavastanoipv.phaseolicolaandCurtobacteriumflaccumfacienspv.flaccumfaciensin soybean[J].ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2015， 27(9):1612-1618. (in Chinese with English abstract)

[8] 韓廣濤， 楊志輝， 朱杰華， 等. 雙重PCR技術(shù)檢測馬鈴薯環(huán)腐病菌和黑脛病菌方法的建立[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011，44(20):4199-4206.

HAN G T， YANG Z H， ZHU J H， et al. Development of duplex PCR assay for detection ofClavibactermichiganensissubsp.sepedonicusandPectobacteriumatrosepticafrom potato[J].ScientiaAgriculturaSinica， 2011， 44(20):4199-4206. (in Chinese with English abstract)

[9] 陳慶河， 李本金， 蘭成忠， 等. 雙重 PCR 檢測馬鈴薯晚疫病菌和青枯病菌方法的建立及應(yīng)用[J]. 植物病理學(xué)報， 2009， 39(6): 578-583.

CHEN Q H， LI B J， LAN C Z， et al. Development and application of duplex PCR assay for detection ofPhytophthorainfestansandRalstoniasolanacearum[J].ActaPhytopathologicaSinica， 2009， 39(6): 578-583. (in Chinese with English abstract)

[10] PRICE J A， SMITH J， SIMMONS A， et al. Multiplex real-time RT-PCR for detection ofWheatstreakmosaicvirusandTritcummosaicvirus[J].JournalofVirologicalMethods， 2010， 165(2): 198-201.

[11] 屈連偉，蘇君偉， 趙展，等. 國產(chǎn)郁金香種球產(chǎn)業(yè)化及市場營銷策略探析[J].園藝與種苗，2016(9):42-45.

QU L W， SU J W， ZHAO Z， et al. Discussion on industrialization of domestic tulip bulbs and marketing strategies[J].Horticulture&Seed， 2016(9):42-45. (in Chinese with English abstract)

[12] 李娜， 周國粱， 印麗萍， 等. 進境風(fēng)信子種球中菊基腐病菌的鑒定[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2012， 28(3)：42-45.

LI N， ZHOU G L， YIN L P， et al. Identification ofDickeyachrysanthemiin introduced hyacinth bulbs[J].ActaAgriculturaeShanghai， 2012， 28(3):42-45. (in Chinese with English abstract)