吳玉靜，曹先通，蔡國(guó)榮，肖秀娟，李芳飛，楊志超 綜述，鄭振中△ 審校

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科 330006)

細(xì)胞死亡是機(jī)體發(fā)育、清除衰老受損細(xì)胞、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要過(guò)程，現(xiàn)公認(rèn)的細(xì)胞死亡方式分為“程序性死亡”和壞死。 “程序性死亡”包括凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)，是細(xì)胞按照特定信號(hào)通路進(jìn)行的主動(dòng)、有序的調(diào)控過(guò)程。部分壞死在特定死亡進(jìn)程中可以像凋亡一樣，按照特定程序、由基因調(diào)控，這種死亡方式被命名為necroptosis[1]。

1 Necroptosis的提出

以往觀點(diǎn)認(rèn)為壞死是細(xì)胞進(jìn)行的被動(dòng)、無(wú)序的死亡方式，近年來(lái)深入探索發(fā)現(xiàn)凋亡和壞死在很多情況下共同存在，共同參與細(xì)胞死亡進(jìn)程。necroptosis是一種caspase非依賴性的死亡方式，它的死亡進(jìn)程更迅速，對(duì)機(jī)體的危害更大。由于caspase活性需要一定量ATP的支持，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)炎癥、缺血損傷等情況時(shí)，能量代謝受到抑制，ATP生成不足導(dǎo)致caspase活性下降，機(jī)體沿necroptosis方向進(jìn)展[2]。這種在凋亡受阻時(shí)由死亡受體、配基活化啟動(dòng)、受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIP1)/RIP3介導(dǎo)、能被Nec-1特異性抑制的一類細(xì)胞死亡方式稱為necroptosis。此外發(fā)現(xiàn)necroptosis能被其特異性小分子抑制劑Nec-1抑制，在caspase-8缺陷的小鼠中使用凋亡特異性抑制劑z-VAD-fmk不能抑制necroptosis[3]。研究發(fā)現(xiàn)necroptosis介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中，細(xì)胞中無(wú)凋亡小體，但可發(fā)現(xiàn)自噬小體，同時(shí)細(xì)胞可檢測(cè)出損傷相關(guān)模式分子(damage-associated molecular pattern molecules,DAMPs)[4]。

2 Necroptosis的分子調(diào)控機(jī)制

2.1Necroptosis通路啟動(dòng) necroptosis信號(hào)通路需要死亡受體(death receptor,DR)與配基結(jié)合啟動(dòng)，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)主要有TNF-α/TNFR1腫瘤壞死因子-α/重組人1型腫瘤壞死因子受體、Fas配基(Fas-L)/Fas、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配基(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)/TRAILR、細(xì)胞表面Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)及DNA依賴性IFN調(diào)節(jié)因子(DNA-dependent activator of IFN regulatory factors,DAI)，其中TNF-α/TNFR1是研究相對(duì)較清楚的啟動(dòng)因子[5]。

在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，TNFR1的胞內(nèi)段與沉默死亡結(jié)構(gòu)域(silence of death domain,SODD)結(jié)合后構(gòu)象改變，繼而與TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(TNFR1-associated death domain,TRADD)結(jié)合，招募RIP、TNF受體相關(guān)因子2/5(TNF receptor associated factor,TRAF 2/5)、凋亡抑制蛋白(cellular inhibitor of apoptosis proteins,cIAP1/2)、LUBAC復(fù)合體(linear ubiquitin chain assembly complex)形成TNFR復(fù)合體Ⅰ(complex Ⅰ)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[6]。

2.2RIPs家族在necroptosis中的作用及機(jī)制 RIP是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，共7個(gè)成員，該蛋白家族中含有一類高度保守的絲/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。RIP1和RIP3與細(xì)胞凋亡和necroptosis關(guān)系密切，其中RIP1是Nec-1抑制necroptosis的靶向位點(diǎn)。

RIP1含671個(gè)氨基酸，既可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、necroptosis，又在TNF-NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞生存通路中起關(guān)鍵作用。RIP1由3部分組成，N端是絲/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domain,KD)，是RIPs家族成員共有的組成部分；中間是RIP同源結(jié)合基序(RIP family homotypic interaction motifs,RHIM)，C-端是與TRADD結(jié)合的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain,DD)。每個(gè)RIPs成員具有各自獨(dú)特的C-端，這樣的結(jié)構(gòu)決定了它們具有不同的生物學(xué)功能，參與不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

RIP3由518個(gè)氨基酸組成，C-端不含死亡結(jié)構(gòu)域，由RHIM組成，在RIPs家族中只有RIP1和RIP3含有RHIM結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域在necroptosis調(diào)控通路中具有十分重要的作用。研究證明RIP3能使caspase-8缺陷的小鼠胚胎致死，敲除RIP3后，necroptosis進(jìn)程受阻，但RIP1介導(dǎo)的凋亡途徑不受影響。necroptosis通路中RIP1與RIP3緊密結(jié)合形成RIP1-RIP3復(fù)合體(necrosome)并相互磷酸化是信號(hào)通路能夠正常發(fā)生的關(guān)鍵，且此現(xiàn)象為necroptosis獨(dú)有。此外RIP3下游信號(hào)分子混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)寡聚化和質(zhì)膜轉(zhuǎn)位可能是necroptosis通路進(jìn)行的關(guān)鍵[7]。

2.3Necrosome在necroptosis中的調(diào)控作用及機(jī)制 TNFR復(fù)合體Ⅰ中RIP1泛素化是決定心肌細(xì)胞存活或死亡的關(guān)鍵，第377位賴氨酸是主要泛素化位點(diǎn)。當(dāng)RIP1被多聚泛素化時(shí)，招募轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1(transforming growth factor-β activated kinase1,TAK1)、TAK結(jié)合蛋白2(TAK1-binding protein 2,TAB2)和TAB3,形成TAK1-TAB2-TAB3復(fù)合物，激活NF-κB通路介導(dǎo)細(xì)胞生存。在cIAPs與TAK1介導(dǎo)的細(xì)胞泛素化中，抑制或敲除cIAPs后RIP1泛素化受阻滯而呈現(xiàn)明顯的去泛素化狀態(tài)，引起心肌細(xì)胞走向凋亡或necroptosis[8]。在去泛素化酶cylindromatosis(CYLD)作用下，RIP1從TNFR復(fù)合體Ⅰ中解離釋放到細(xì)胞質(zhì)，招募caspase-8、Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Fas-associated protein via a death domain,FADD)和TRADD形成TNFR復(fù)合體Ⅱ(complex Ⅱ)，當(dāng)TNFR復(fù)合體Ⅱ中caspase-8聚集活化后，形成TNFR復(fù)合體Ⅱa，啟動(dòng)經(jīng)典外源性凋亡通路，同時(shí)caspase-8降解RIP1和RIP3，阻斷necroptosis進(jìn)程[9]。z-VAD-fmk抑制凋亡通路或敲除caspase-8，RIP1和RIP3降解受到抑制，RIP3通過(guò)C端RHIM與RIP1結(jié)合形成RIP1-RIP3 necrosome，necrosome磷酸化激活RIP3進(jìn)一步促進(jìn)necroptosis進(jìn)行[10]。necrosome的形成及相互磷酸化在necroptosis通路中發(fā)揮十分重要作用，Nec-1靶向作用于RIP1，抑制necrosome的形成而阻斷necroptosis進(jìn)程。

2.4RIP1-RIP3-MLKL在necroptosis分子信號(hào)通路中的作用 necrosome如何激活下游信號(hào)通路，仍未完全研究清楚。研究發(fā)現(xiàn)，MLKL可能是RIP3激酶下游底物，necroptosis信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，此外還發(fā)現(xiàn)一種小分子物質(zhì)necrosulfonamide，能夠作用于MLKL的N-端，使N-端喪失功能[6]。有研究發(fā)現(xiàn)RIP3和MLKL具有典型的激酶折疊，MLKL通過(guò)AMP-PNP形成非活性構(gòu)象與RIP3穩(wěn)定結(jié)合，在RIP3-MLKL復(fù)合體中，RIP3與MLKL各自的C-端、N-端發(fā)生改變，RIP3發(fā)生αC螺旋和活性環(huán)的顯著構(gòu)象改變。MLKL的N端含有4螺旋結(jié)構(gòu)域(four-helix bundle domain,4HBD)，是MLKL發(fā)揮效應(yīng)的主要部分；C-端為激酶結(jié)構(gòu)域，含有同源激酶序列蛋白，具有疏水性，二者通過(guò)2個(gè)α-4HBD連接，未被激活的MLKL在細(xì)胞質(zhì)中以單體存在[11]。當(dāng)RIP3第227位絲氨酸發(fā)生自磷酸化后，MLKL第357位蘇氨酸/358位絲氨酸位點(diǎn)磷酸化，引起MLKL單體發(fā)生寡聚化，寡聚后的MLKL N-端結(jié)合磷脂酰肌醇磷脂(phosphatidylinositol phosphate lipids,PIPs),C-端結(jié)合線粒體特異性心磷脂(cardiolipin,CL),使細(xì)胞質(zhì)中的MLKL聚集到質(zhì)膜，引起質(zhì)膜轉(zhuǎn)位。MLKL單體寡聚化和質(zhì)膜轉(zhuǎn)位在necroptosis進(jìn)程扮演重要角色，N-端4HBD是主要功能部分，擾亂N-端功能，MLKL質(zhì)膜轉(zhuǎn)位受到阻礙[12-13]。敲除MLKL后細(xì)胞對(duì)死亡敏感性下降，抑制PI(5)P或PI(4,5)P引起necroptosis進(jìn)程受阻，但均不會(huì)影響凋亡通路進(jìn)行。

MLKL發(fā)生質(zhì)膜轉(zhuǎn)位后如何誘導(dǎo)necroptosis的發(fā)生發(fā)展，現(xiàn)仍未完全闡述清楚?，F(xiàn)有以下幾種觀點(diǎn)仍存在爭(zhēng)論：(1)線粒體蛋白磷酸酶PGAM5(phosphoglycerate mutase family member 5，PGAM5)可能與necroptosis進(jìn)程有關(guān)。MLKL與PGAM5可能是RIP3下游兩個(gè)重要信號(hào)分子，MLKL激活引起PGAM5活化并磷酸化[14-16]。在Ca2+和活性氧(ROS)的作用下形成線粒體攻擊復(fù)合物Ⅲ(mitochondrial attack complex,MAC)，同時(shí)激活動(dòng)力相關(guān)蛋白Drp-1 (dynamin-related protein 1)引發(fā)線粒體裂解，線粒體裂解后ATP生成減少，引起細(xì)胞發(fā)生necroptosis，線粒體的斷裂為推動(dòng)早期necroptosis進(jìn)程起到重要作用；此外Drp-1激活產(chǎn)生大量氧自由基，直接導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞器腫脹崩解，細(xì)胞走向 necroptosis進(jìn)程；(2)MLKL發(fā)生寡聚化引起質(zhì)膜轉(zhuǎn)位，細(xì)胞膜離子通道功能紊亂使膜內(nèi)外離子平衡改變，引起細(xì)胞發(fā)生necroptosis[17]；(3)MLKL作為質(zhì)膜上募集Ca2+和Na+通道的平臺(tái)發(fā)揮推動(dòng)necroptosis的作用；但近期XIA等[18]發(fā)現(xiàn)，MLKL形成一種新型陽(yáng)離子通道，對(duì)Mg2+通透性強(qiáng)并且允許其優(yōu)先通過(guò)，對(duì)Na+和K+通透性弱，但不通透Ca2+；(4)MLKL通過(guò)N-端與PIPs結(jié)合后募集到質(zhì)膜上直接作為成孔復(fù)合體發(fā)揮作用[16,19]。

2.5RIP1-RIP3-鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ(Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase,CaMKⅡ)在necroptosis分子信號(hào)通路中的作用 不同于經(jīng)典的RIP1-RIP3-MLKL信號(hào)通路介導(dǎo)的necroptosis，ZHANG等[20]發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注或氧化應(yīng)激中，RIP3直接磷酸化及間接氧化激活CaMKⅡ，通過(guò)PIP3-CaMKⅡ-線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)途徑介導(dǎo)心肌細(xì)胞程序性壞死，引起心肌損傷、惡性心室重構(gòu)和心力衰竭；敲除RIP3或抑制CaMKⅡ能夠預(yù)防心肌缺氧和氧化應(yīng)激引起的necroptosis,過(guò)表達(dá)RIP3促進(jìn)necroptosis的發(fā)展。

3 Necroptosis與凋亡、自噬的關(guān)系

凋亡是一種caspase依賴性的細(xì)胞死亡方式，一直以來(lái)凋亡被認(rèn)為是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的經(jīng)典死亡方式，當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)通路阻斷時(shí)，necroptosis以一種替代的形式參與細(xì)胞死亡[21]?，F(xiàn)階段認(rèn)為，necroptosis和凋亡是互補(bǔ)的信號(hào)通路，具有共同的啟動(dòng)分子、激酶和蛋白酶，通過(guò)TNFR或TLR啟動(dòng)，招募RIP1、FADD、TRADD形成復(fù)合體介導(dǎo)細(xì)胞死亡通路[22]。隨著研究的深入，越來(lái)越多學(xué)者發(fā)現(xiàn)在很多疾病中necroptosis和凋亡共同參與細(xì)胞的死亡進(jìn)程。敲除RIP3或MLKL阻斷TNF-α誘導(dǎo)的necroptosis進(jìn)程后，可以促進(jìn)necroptosis向凋亡轉(zhuǎn)換，但是當(dāng)RIP1的活性被抑制，這種轉(zhuǎn)換效果會(huì)減弱。使用zVAD-fmk抑制凋亡通路,caspase-8的活性被抑制，RIP1磷酸化進(jìn)而促進(jìn)凋亡向necroptosis的轉(zhuǎn)換。

自噬是一種具有自我更新和自我保護(hù)機(jī)制的細(xì)胞死亡方式，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)成分的降解，對(duì)維持體內(nèi)平衡起至關(guān)重要的作用。自噬可以通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)過(guò)剩的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，適度的自噬可保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境刺激的影響，但是當(dāng)自噬被過(guò)度激活或抑制時(shí)，介導(dǎo)損傷性作用將導(dǎo)致疾病[23]。OBERST等[24]認(rèn)為招募FASS與自噬體結(jié)合可以直接激活RIP1和RIP3。在TNF-α或饑餓狀態(tài)下介導(dǎo)的自噬可以抑制necroptosis，敲除RIP1或用Nec-1可以抑制自噬信號(hào)通路的進(jìn)程。這些結(jié)果顯示，自噬本身可能并不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，它可能是necroptosis的下游信號(hào)通路。然而部分研究者認(rèn)為，自噬并不僅僅可以介導(dǎo)細(xì)胞生存，其本身也會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。OSBORN等[25]發(fā)現(xiàn)FADD缺陷的T細(xì)胞增殖介導(dǎo)的necroptosis并不會(huì)影響自噬，提示自噬并不是necroptosis通路中的一部分，自噬與necroptosis是兩種完全獨(dú)立的細(xì)胞死亡方式。因此對(duì)于自噬與necroptosis的關(guān)系，至今依然沒(méi)有確切的定論。

截至目前，對(duì)于necroptosis與凋亡和自噬這3種細(xì)胞死亡方式之間的相互關(guān)系及具體的信號(hào)分子機(jī)制依然未闡述清楚，需要更多的研究來(lái)探索。

4 Necroptosis在心血管疾病中的研究進(jìn)展

在鼠心肌缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)，給予一定劑量Nec-1能夠使缺血再灌注急性期的心肌損傷明顯減小，慢性期心肌纖維化減弱，梗死灶體積與對(duì)照組相比明顯縮小。在缺氧誘導(dǎo)的心肌缺血損傷中，使用抑制劑Nec-1，凋亡信號(hào)通路caspase-3表達(dá)相對(duì)增加；使用凋亡抑制劑z-VAD-fmk，necroptosis信號(hào)通路RIP3表達(dá)量增加。通過(guò)大量研究發(fā)現(xiàn)在急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)模型中凋亡占據(jù)了重要的地位，其中線粒體通路研究相對(duì)較充分，而TNF-α死亡受體通路證據(jù)較少。后期通過(guò)不斷研究證實(shí)在大鼠AMI模型中有necroptosis信號(hào)通路RIP1、RIP3蛋白表達(dá)，提示心肌細(xì)胞的死亡方式不僅只有凋亡與自噬，necroptosis也發(fā)揮了作用，并且在一定條件下necroptosis與凋亡共同存在且相互轉(zhuǎn)化。有文獻(xiàn)報(bào)道在病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)中發(fā)現(xiàn)了凋亡和自噬，但使用caspase抑制劑處理病毒感染的心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞的死亡進(jìn)程加快，具體機(jī)制目前仍不清楚。

通過(guò)不斷深入研究，necroptosis參與包括感染和炎癥性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、腦缺血性疾病等疾病進(jìn)程，近年來(lái)necroptosis在急性心肌缺血再灌注損傷及心力衰竭中的作用受到廣泛重視，使用Nec-1能夠明顯減弱心肌損傷。在心肌炎或心瓣膜病等其他心血管疾病中是否也存在necroptosis?具體信號(hào)調(diào)控機(jī)制是什么?阻止進(jìn)程能否保護(hù)心肌細(xì)胞?這些問(wèn)題至今還沒(méi)有確切定論。隨著necroptosis研究的日益深入，其機(jī)制的探索也取得了一定進(jìn)展，其將有望為研究心肌細(xì)胞壞死的病理機(jī)制、治療方向及干預(yù)措施提供新的突破口。