孔德望，張克強 ，房 芳，高文萱，梁軍鋒 ，梁 雨，杜連柱*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽 110866；2.農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191；3.天津環(huán)科源環(huán)保科技有限公司，天津 300191）

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)?；目焖侔l(fā)展，畜禽糞便產(chǎn)量逐年增加，正確處理和利用養(yǎng)殖廢棄物已成為養(yǎng)殖業(yè)健康良性發(fā)展的關(guān)鍵因素。厭氧消化因其工藝相對簡單、活性污泥量少而逐漸成為有機廢棄物處理的主要技術(shù)之一，在畜禽養(yǎng)殖廢棄物處理和資源化利用中得到越來越廣泛的應(yīng)用。

厭氧消化性能受溫度、pH、有機負(fù)荷、回流等眾多因素的影響，其中消化液的回流能夠減少微生物流失和沼液排放量、提高發(fā)酵體系的緩沖能力、緩解沼液后續(xù)深度處理的壓力[1]。Estevez等[2]研究了消化液回流對牛糞和汽爆過的沙柳混合半連續(xù)厭氧發(fā)酵的作用，結(jié)果表明，1∶1的回流比能夠提高沼氣中的甲烷含量，同時甲烷產(chǎn)率提高16.0%。吳樹彪等[3]在牛糞的厭氧發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)，固液分離后的消化液回流使基質(zhì)的產(chǎn)甲烷率提高16.3%，但隨著回流的進(jìn)行，日產(chǎn)甲烷量呈下降趨勢。Nordberg等[4]的研究結(jié)果表明，消化液回流能夠增加青貯苜蓿厭氧發(fā)酵體系的pH、堿度和穩(wěn)定性。高新星等[5]對比了固體產(chǎn)酸發(fā)酵反應(yīng)器中消化液浸泡和噴淋兩種回流方式對豬糞和秸稈混合原料兩相厭氧消化性能的影響，發(fā)現(xiàn)在消化液浸泡回流方式下累積產(chǎn)氣量是噴淋回流的2倍，而且穩(wěn)定性更好，單位質(zhì)量總固體產(chǎn)氣量可達(dá)217.88 mL·g-1。

以往的研究主要針對固液分離后的消化液回流，重點集中在對產(chǎn)氣性能的影響，對消化液直接回流及直接回流過程中微生物的群落變化及其與產(chǎn)氣之間的關(guān)系研究不足。鄧遵等[6]研究了ABR反應(yīng)器出水回流對微生物種群的影響，結(jié)果表明，與不回流相比，回流反應(yīng)器中真細(xì)菌、古細(xì)菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和耗氫產(chǎn)乙酸菌的相對豐度分別高出8.5%、4.5%、3.5%和3.0%。Zamanzadeh等[7]研究了消化液回流對食品廢水厭氧消化中微生物的影響，結(jié)果表明，中溫條件下，回流和不回流體系中優(yōu)勢古菌均為甲烷鬃毛菌屬，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差別，門水平上優(yōu)勢菌分別為厚壁菌門和綠屈撓菌門，而高溫條件下的微生物群落則非常相似。

本試驗采用實驗室豬糞中溫厭氧消化連續(xù)試驗，研究消化液直接回流過程中微生物群落結(jié)構(gòu)組成變化特征，并分析其與產(chǎn)氣性能的關(guān)系，為優(yōu)化規(guī)模化養(yǎng)殖場大中型沼氣工程的運行參數(shù)、提高產(chǎn)氣效率提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬糞取自天津市西青區(qū)某養(yǎng)殖有限公司，取當(dāng)日產(chǎn)鮮豬糞冷藏于（4±1）℃的冰箱。接種物取自實驗室正常運行的有機負(fù)荷（OLR）為 4.0 g·L-1·d-1的豬糞中溫混合厭氧反應(yīng)器（Continuous Stirred Tank Reactor，CSTR）。底物與接種物的理化指標(biāo)見表1。

表1 底物和接種物的基本性質(zhì)Table 1 Characteristics of substrates and inoculum sludge

1.2 試驗裝置

試驗裝置為有機玻璃材質(zhì)的CSTR反應(yīng)器，有效容積7 L。反應(yīng)器頂部安裝攪拌裝置，設(shè)有進(jìn)料口、排氣口，側(cè)部設(shè)上下兩個取樣口，底部設(shè)有出料口，反應(yīng)器采用雙層結(jié)構(gòu)，恒溫水浴加熱（圖1）。

1.3 試驗設(shè)計

圖1 厭氧發(fā)酵試驗裝置圖Figure 1 Experimental equipment of anaerobic digestion

厭氧發(fā)酵的OLR為4.0 g·L-1·d-1（以VS計），水力停留時間（HRT）為30 d。試驗啟動前，在反應(yīng)器內(nèi)裝填4 L接種物，加水至7 L。啟動階段，每天排出約233.3 mL的消化液，定量稱取豬糞加蒸餾水至約233.3 mL，混勻后填充至反應(yīng)器。運行穩(wěn)定后，出料的50%替代蒸餾水進(jìn)入反應(yīng)器，回流試驗共進(jìn)行219 d。反應(yīng)器通過雙層水浴加熱，保持發(fā)酵溫度為（35±0.5）℃。試驗采取間歇攪拌方式，每攪拌2 h停10 min，轉(zhuǎn)數(shù)為 50 r·min-1。

每天測量產(chǎn)氣量，每2 d測量氣體中CH4和CO2的百分含量，每3 d取消化液分析pH值、揮發(fā)性脂肪酸（VFAs，乙酸、丙酸、丁酸和戊酸）、氨氮等指標(biāo)。取接種物（S0）、試驗第 68 d（S1，1～68 d，短期回流）和第219 d（S2，69～219 d，長期回流）消化液樣品（重復(fù)取樣3次）用于微生物群落分析。

1.4 理化指標(biāo)分析

產(chǎn)生的沼氣收集于氣袋中，通過濕式氣體流量計測量體積，消化液pH、氨氮濃度采用標(biāo)準(zhǔn)方法測定[8]，CH4和CO2的百分含量及VFAs濃度采用前期試驗[9]的處理及分析方法。

1.5 Miseq高通量測序分析

1.5.1 樣品DNA提取

樣品DNA采用Fast DNAs Spin Kit（Mpbio，美國）試劑盒提取，S0、S1和S2的重復(fù)樣品（3個）分別提取DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，通過超微量分光光度計（Nano Drop 2000，Thermo Scientific，Wilmington，美國）測定濃度，然后將提取的DNA混勻。

1.5.2 PCR擴增

細(xì)菌擴增引物為341F（5′-CCTACACGACGCTCT TCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和 805R（5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATT CCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′），產(chǎn)甲烷古菌擴增引物為 349F[5′-CCCTACACGACGCTCTTCCG ATCTN（barcode）GYGCASCAGKCGMGAAW-3′]和806R（5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC CAGGACTACVSGGGTATCTAAT-3′）[10]。采用 PCR 儀（C100 Thermal Cycler）對樣品16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴增，擴增反應(yīng)體系及條件參照文獻(xiàn)[11-12]，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，采用生工瓊脂糖回收試劑盒（Cat：SK8131）對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物用Qubit 2.0定量。

1.5.3 Miseq測序

樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司，測序平臺為Miseq 2x300，測序后的DNA序列進(jìn)行拼接，通過barcode標(biāo)簽序列區(qū)分樣品序列，采用Prinseq（0.20.4）對樣本序列做質(zhì)量控制，在QIIME中調(diào)用Uclust（1.1.579）軟件，設(shè)置97%相似性，對有效DNA序列數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元（OTU）分類，采用RDP軟件比對Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類，在門、綱、目、科和屬分類水平上統(tǒng)計樣本的物種豐度。采用Mothur軟件計算種群豐富度指數(shù)（Chao指數(shù)、ACE指數(shù)）和群落多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）。

2 結(jié)果與討論

2.1 沼氣發(fā)酵性能參數(shù)

表2為厭氧發(fā)酵在短期長期回流下沼氣產(chǎn)率、氨氮濃度、乙酸濃度、pH值等參數(shù)的平均值。由表可見，消化液回流的平均VS產(chǎn)氣率由409 mL·g-1升高到477 mL·g-1，氨氮、乙酸的平均濃度和pH值也明顯升高，但沼氣中的CH4百分含量有所降低。

表2 沼氣產(chǎn)率及反應(yīng)器關(guān)鍵指標(biāo)Table 2 Variations of biogas yield and key factors

2.2 微生物群落多樣性分析

在OTUs（操作分類單位）為97%的相似性水平下，對厭氧消化過程中細(xì)菌和古菌微生物群落多樣性進(jìn)行分析比較（圖2、圖3和表3）。由圖2和圖3可知，盡管細(xì)菌和古菌的稀釋曲線未達(dá)到平坦?fàn)顟B(tài)，但Shannon指數(shù)曲線隨著序列數(shù)的增加迅速趨于平坦，表明測序數(shù)量能夠反映樣品中絕大多數(shù)微生物信息[11]。從圖2稀釋曲線和表3中Chao和ACE指數(shù)可知，隨著消化時間的延長，厭氧發(fā)酵體系中細(xì)菌和古菌群落的豐富度均有所提高，細(xì)菌的豐富度增加幅度明顯高于古菌。

表征微生物群落多樣性的Shannon指數(shù)變化趨勢與Chao、ACE指數(shù)相似，隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈升高趨勢，表明細(xì)菌群落多樣性增加，群落的復(fù)雜程度升高，而古菌的Shannon指數(shù)基本沒有變化，表明長期消化液回流對古菌群落的多樣性和復(fù)雜程度影響不大。厭氧發(fā)酵體系中，微生物群落多樣性越高產(chǎn)沼氣性能越好，雖然S2中產(chǎn)甲烷古菌的多樣性沒有明顯增加，但細(xì)菌多樣性提高了16.1%，從而導(dǎo)致了沼氣產(chǎn)率的提升。

Simpson指數(shù)體現(xiàn)了優(yōu)勢物種生物量占群落生物總量的比重，該指數(shù)越大表明優(yōu)勢菌群生物量占總生物量比重越小，反之則優(yōu)勢菌群生物量占總生物量比重越大[12]。與Shannon指數(shù)不同，隨著厭氧發(fā)酵的進(jìn)行細(xì)菌的Simpson指數(shù)降低，而產(chǎn)甲烷古菌的升高，表明細(xì)菌優(yōu)勢菌群的生物量占總生物量的比例增大，古菌優(yōu)勢菌群的占比減小。

圖2 細(xì)菌和古菌的稀釋曲線Figure 2 Rarefaction curves of bacteria and archaeal communities

圖3 細(xì)菌和古菌的Shannon指數(shù)曲線Figure 3 Shannon index curves of bacteria and archaeal communities

表3 發(fā)酵過程中微生物豐富度和多樣性變化Table 3 Richness and diversity of microbial communities during digestion

綜合各指數(shù)可以看出，與產(chǎn)甲烷古菌相比，厭氧發(fā)酵體系中的細(xì)菌具有更高的微生物種群豐富度和多樣性，與已有研究報道相一致，這主要是由細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌遺傳發(fā)育的多樣性差異造成的[13]。

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

不同發(fā)酵時期樣品中細(xì)菌群落在門、綱和屬的分類水平見圖4。由圖4a可知，細(xì)菌主要屬于8個門，其中厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要的優(yōu)勢菌群，在S0、S1和S2中的相對豐度分別為62.79%、71.66%、81.46%和 19.39%、20.32%、6.74%；其次是變形菌門（Proteobacteria）和無壁菌門（Tenericutes），相對豐度分別為 2.59%、1.84%、3.23%和0.04%、0.11%和1.96%；未分類菌門則為12.75%、3.41%和3.36%。

厚壁菌門是厭氧發(fā)酵水解酸化階段最優(yōu)勢的細(xì)菌類群，能夠產(chǎn)生降解復(fù)雜有機物的纖維素酶、蛋白酶和各種胞外水解酶，在高濃度氨氮的厭氧消化體系中，很多已知的同型乙酸氧化（SAO）菌屬于該門類微生物[14-15]。Sundberg等[16]的研究結(jié)果顯示，在餐廚和屠宰場等廢棄物的中溫混合厭氧發(fā)酵中，厚壁菌門的相對豐度達(dá)到83%。Li等[14]對我國12個以豬場糞污為原料的厭氧沼氣工程微生物分析結(jié)果顯示，厚壁菌門的平均豐度為63.73%，其在5個沼氣工程中占絕對優(yōu)勢，平均豐度達(dá)到78.44%，另外，牛場和豬場廢棄物厭氧消化中，游離氨與厚壁菌門成顯著正相關(guān)。試驗中不同階段厚壁菌門均占絕對優(yōu)勢，而且隨著回流時間的延長其相對豐度逐漸升高，達(dá)到81.46%，這可能與體系中氨氮濃度逐漸升高有關(guān)。擬桿菌門和變形菌門是污泥水解和產(chǎn)酸的主要菌。試驗中，發(fā)酵液長期回流對擬桿菌門細(xì)菌影響明顯，相對豐度從初期的20%左右降至219 d時的6.74%，而變形菌門和無壁菌門變化較小。

屬于厚壁菌門（Firmicutes）的梭菌綱（Clostridia）包含數(shù)量眾多的微生物，具有降解蛋白、脂肪和碳水化合物等多種物質(zhì)的功能，同時能夠?qū)⒁宜岷腿樗徂D(zhuǎn)化為H2和CO2[17-18]。試驗中，梭菌綱在不同時期均占明顯優(yōu)勢，占比分別為58.62%、65.60%和68.19%（圖4b），相對豐度逐漸升高，表明該種群在水解酸化過程中較其他綱微生物具有更強的競爭力，同時反映出消化液回流的厭氧消化系統(tǒng)中梭菌綱與氫營養(yǎng)型甲烷菌的互養(yǎng)關(guān)系占主導(dǎo)，并呈加強趨勢[18]。另一種優(yōu)勢微生物為擬桿菌綱（Bacteroidia），占比分別為2.45%、4.31%和4.92%。其他主要微生物相對豐度幾乎均呈升高趨勢，但不大于3.88%。

圖4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化Figure 4 Variation of bacteria communities structure

圖4c為屬分類水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，雖然大量的細(xì)菌序列未能分類，但屬水平上的群落結(jié)構(gòu)仍能提供反應(yīng)器中微生物群落功能的重要信息[18-19]。由圖可知，相對豐度高于1.00%的細(xì)菌基本屬于厚壁菌門、梭菌綱，以梭菌屬（Clostridium）為優(yōu)勢菌屬，相對豐度由S0的35.44%經(jīng)S1的35.77%升高至S2的39.10%，與日平均產(chǎn)氣率的變化一致，表明日平均產(chǎn)氣率與梭菌屬的豐度呈正相關(guān)。第二優(yōu)勢菌屬為具有纖維素降解能力的Saccharofermentans，相對豐度從11.64%經(jīng)13.9%下降到5.25%。未分類的細(xì)菌在各個階段的相對含量分別為28.57%、27.43%和20.66%，表明還存在較多的細(xì)菌尚未被分類，需要更深入的研究和挖掘。

2.4 古菌群落結(jié)構(gòu)變化

圖5為消化液回流不同階段產(chǎn)甲烷古菌在門、綱、目、科和屬水平上的群落結(jié)構(gòu)。由圖5a可知，在S0、S1和S2中，產(chǎn)甲烷菌在門水平上非常單一，廣古菌門（Euryarchaeota）占絕對優(yōu)勢，其相對豐度分別為94.76%、99.89%和 99.59%，泉古菌門（Crenarchaeota）則只占4.40%、0.08%和0.11%。綱水平上（圖5b）甲烷微菌綱（Methanomicrobia）和甲烷桿菌綱（Methanobacteria）是優(yōu)勢微生物，但隨消化液回流時間的延長表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，甲烷微菌綱由S0的53.35%升高至S1和S2的56.97%和78.09%，而甲烷桿菌綱則由S0的38.34%最終下降至S2的16.78%。

目水平上，各產(chǎn)甲烷菌的相對豐度大小表現(xiàn)為甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）＞甲烷桿菌目（Methanobacteriales）＞甲烷微菌目（Methanomicrobiales），消化過程中，前者處于升高的趨勢，中者下降，后者下降，但變化不大，科水平上的古菌相對豐度變化與目水平一致。有研究表明，不同產(chǎn)甲烷菌對體系中有害物質(zhì)或環(huán)境因子具有不同的抵抗能力，高沼氣產(chǎn)率下，甲烷八疊球菌目（科）占比高于其他古菌[20-22]。試驗中，隨著回流時間的延長，雖然對產(chǎn)甲烷微生物具有毒害作用的氨氮的濃度逐漸升高達(dá)到5371 mg·L-1，但沼氣的VS產(chǎn)率達(dá)到477 mg·g-1（表2），這與高氨氮濃度下甲烷八疊球菌科的相對豐度較高有關(guān)。

圖5 產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)變化Figure 5 Variation of archaeal communities structure

雖然整個發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷古菌的多樣性差異較?。ū?），但在屬水平上分類的差異卻非常明顯（圖5e），可分為7個屬，其中甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和甲烷球菌屬（Methanosphaera）為優(yōu)勢菌屬。甲烷八疊球菌屬相對豐度由S0的23.99%依次升高到S1的56.55%和S2的72.28%，而甲烷短桿菌和甲烷球菌屬的相對豐度總體呈降低趨勢，分別由16.34%、21.71%降低至3.70%、12.93%，表明回流體系的產(chǎn)氣率與甲烷八疊球菌屬的相對豐度呈正相關(guān)，與甲烷短桿菌屬和甲烷球菌屬呈負(fù)相關(guān)。其他菌屬還包括甲烷鬃毛菌屬（Methanosaeta）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、熱裸單胞菌屬（Thermogymnomonas）、甲烷螺菌屬（Methanospirillum）。

作為畜禽糞污厭氧發(fā)酵中常見的優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌屬，甲烷八疊球菌屬是已知的唯一能夠利用所有產(chǎn)甲烷途徑的菌屬，很多文獻(xiàn)都將其歸結(jié)為乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌[23-24]，然而這需要進(jìn)一步研究。試驗中，隨著發(fā)酵時間的延長，甲烷八疊球菌屬的相對豐度升高，而包括甲烷短桿菌屬、甲烷球菌屬和甲烷囊菌屬（Methanoculleus）等在內(nèi)的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的總占比在S0和S1中基本相同（43.10%和43.14%），在S2中則下降至22.54%，表明在回流初期多種微生物對甲烷產(chǎn)生的貢獻(xiàn)相當(dāng)，隨著回流時間的延長，逐漸以甲烷八疊球菌屬的代謝為主，其主要原因可能是：（1）接種物取自長期運行的豬糞厭氧消化反應(yīng)器，經(jīng)過高濃度氨氮的馴化，具有較高的氨氮耐受濃度；（2）甲烷八疊球菌屬對氨氮具有高達(dá)7000 mg·L-1的耐受濃度[25]，雖然體系中氨氮濃度達(dá)到 5371 mg·L-1，但未對甲烷八疊球菌屬產(chǎn)生抑制。

值得注意的是，同屬乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的甲烷鬃毛菌屬和甲烷八疊球菌屬在本研究中表現(xiàn)迥然不同，甲烷八疊球菌屬占絕對優(yōu)勢，而甲烷鬃毛菌屬S0時為24.14%，S1和S2時則低于0.05%，主要原因是甲烷鬃毛菌屬對乙酸和氨氮均比甲烷八疊球菌屬敏感[22]。甲烷鬃毛菌屬只能代謝乙酸，能在低至0.3～1.2 mg·L-1的濃度環(huán)境中生長，在 93.7～140.6 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)為優(yōu)勢菌屬，而甲烷八疊球菌屬所需最小乙酸濃度約為 60.1 mg·L-1，在 234.3～468.6 mg·L-1以上時為優(yōu)勢菌屬[23，25]。試驗中，S1和S2的乙酸濃度分別為 52.5 mg·L-1和 3 397.7 mg·L-1，均不在甲烷鬃毛菌屬的最適乙酸濃度內(nèi)，但是甲烷八疊球菌屬在S2時期處于適宜的乙酸濃度內(nèi)，因此甲烷八疊球菌屬表現(xiàn)出更強的競爭力[26]。另外，有機負(fù)荷也影響乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌。有文獻(xiàn)[27]報道，在低有機負(fù)荷下甲烷鬃毛菌屬占優(yōu)勢，而高有機負(fù)荷下甲烷八疊球菌屬占優(yōu)勢，本試驗 VS 負(fù)荷為 4.0 g·L-1·d-1，處在較高水平。

3 結(jié)論

（1）在消化液回流過程中，細(xì)菌較古菌具有更高的多樣性和豐富度，并且隨著回流時間的延長有所提高，而產(chǎn)甲烷古菌變化不明顯。

（2）消化液回流的不同時期，細(xì)菌以厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）為主，梭菌屬（Clostridium）占絕對優(yōu)勢，古菌以甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）為主，且隨回流時間的延長，優(yōu)勢更加明顯，這與甲烷八疊球菌屬具有高的氨氮和乙酸耐受濃度有關(guān)。

（3）回流過程中，發(fā)酵體系的日平均產(chǎn)氣率與梭菌屬和甲烷八疊球菌屬的相對豐度呈正相關(guān)，而與甲烷短桿菌屬和甲烷球菌屬呈負(fù)相關(guān)。

（4）在219 d的發(fā)酵周期內(nèi)，回流導(dǎo)致氨氮和揮發(fā)性有機酸濃度升高，產(chǎn)氣效率維持在較高水平，雖未表現(xiàn)出抑制作用，但長期運行應(yīng)關(guān)注氨氮濃度變化對微生物和產(chǎn)氣效率的影響。

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